| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 第一篇 BAP1/ASXL1复合物的结构与功能研究 | 第15-64页 |
| 第一章 BAP1/ASXL1复合物的研究背景 | 第15-28页 |
| 1.1 引言 | 第15页 |
| 1.2 真核生物基因表达调控 | 第15-16页 |
| 1.3 染色质 | 第16-20页 |
| 1.3.1 组蛋白 | 第16-17页 |
| 1.3.2 核小体 | 第17-19页 |
| 1.3.3 染色质结构 | 第19-20页 |
| 1.4 组蛋白翻译后修饰 | 第20-23页 |
| 1.4.1 组蛋白翻译后修饰种类 | 第20页 |
| 1.4.2 组蛋白翻译后修饰作用 | 第20-21页 |
| 1.4.3 组蛋白修饰crosstalk | 第21-22页 |
| 1.4.4 组蛋白翻译后修饰的基因组定位 | 第22-23页 |
| 1.5 多梳抑制蛋白复合物1与多梳抑制蛋白复合物2 | 第23-26页 |
| 1.5.1 PRC1 | 第24页 |
| 1.5.2 PRC2 | 第24-25页 |
| 1.5.3 PRC1-PRC2轴 | 第25-26页 |
| 1.6 BAP1与ASXL1 | 第26-27页 |
| 1.7 科学问题 | 第27-28页 |
| 第二章 材料与方法 | 第28-48页 |
| 2.1 生物信息学调研 | 第28页 |
| 2.2 人源BAP1和ASXL1基因的克隆 | 第28-37页 |
| 2.2.1 边界选取 | 第28-29页 |
| 2.2.2 引物设计 | 第29-30页 |
| 2.2.3 PCR扩增片段 | 第30-31页 |
| 2.2.4 PCR产物回收 | 第31-32页 |
| 2.2.5 质粒提取 | 第32页 |
| 2.2.6 DNA酶切 | 第32-33页 |
| 2.2.7 酶切产物(或PCR产物)直接回收 | 第33-34页 |
| 2.2.8 连接DNA片段到载体 | 第34页 |
| 2.2.9 感受态细胞制备 | 第34-35页 |
| 2.2.10 连接产物转化到感受态细胞 | 第35页 |
| 2.2.11 阳性单克隆鉴定 | 第35-36页 |
| 2.2.12 突变(点突变、删除突变、插入突变) | 第36-37页 |
| 2.2.13 共转化 | 第37页 |
| 2.3 BAP1与ASXL1的表达纯化 | 第37-43页 |
| 2.3.1 表达BAP1或ASXL1 DEUBAD | 第37页 |
| 2.3.2 共表达BAP1/ASXL1 DEUBAD | 第37-38页 |
| 2.3.3 His tag融合蛋白的亲和纯化 | 第38-39页 |
| 2.3.4 GST融合蛋白亲和纯化 | 第39页 |
| 2.3.5 重组TEV蛋白酶的表达和纯化 | 第39-40页 |
| 2.3.6 重组SUMO蛋白酶ULP1的纯化 | 第40页 |
| 2.3.7 融合标签去除 | 第40-41页 |
| 2.3.8 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第41-42页 |
| 2.3.9 蛋白质定量-紫外吸收法 | 第42页 |
| 2.3.10 离子交换纯化 | 第42页 |
| 2.3.11 分子筛纯化 | 第42-43页 |
| 2.4 限制性酶解 | 第43页 |
| 2.5 蛋白质晶体生长、数据收集及结构解析 | 第43-44页 |
| 2.5.1 晶体生长 | 第43-44页 |
| 2.5.2 晶体数据收集、还原、解相位、建模及修正 | 第44页 |
| 2.6 体外核小体组装 | 第44-46页 |
| 2.6.1 组蛋白表达、纯化 | 第45页 |
| 2.6.2 核小体组装 | 第45-46页 |
| 2.7 GST pull-down检测蛋白质相互作用 | 第46-48页 |
| 第三章 实验结果 | 第48-64页 |
| 3.1 BAP1/ASXL1复合物的表达纯化 | 第48-55页 |
| 3.1.1 基因克隆 | 第48页 |
| 3.1.2 BAP1的表达纯化 | 第48-49页 |
| 3.1.3 ASXL1 DEUBAD结构域的表达纯化 | 第49-51页 |
| 3.1.4 pETDuet-1和pRSFDuet-1双启动子表达 | 第51-52页 |
| 3.1.5 pET28a-SUMO和pBAD28双质粒不同启动子表达 | 第52-53页 |
| 3.1.6 pET28a-SUMO和pET22b双质粒相同启动子表达 | 第53-55页 |
| 3.2 BAP1/ASXL1复合物的晶体生长、衍射数据收集及处理 | 第55-56页 |
| 3.3 晶体优化 | 第56-58页 |
| 3.3.1 常规优化 | 第56页 |
| 3.3.2 离子交换精细纯化BAP1/ASXL1复合物 | 第56-57页 |
| 3.3.3 试用不同边界的BAP1/ASXL1进行晶体生长 | 第57页 |
| 3.3.4 限制性酶解BAP1/ASXL1 | 第57-58页 |
| 3.4 BAP1 CTE与核小体的相互作用 | 第58-63页 |
| 3.4.1 BAP1 CTE克隆、表达、纯化 | 第59页 |
| 3.4.2 BAP1 CTE与寡聚核小体、小牛胸腺组蛋白和核小体DNA相互作用 | 第59-60页 |
| 3.4.3 BAP1 CTE与重组核小体、H2A/H2B相互作用 | 第60-63页 |
| 3.5 小结与展望 | 第63-64页 |
| 第二篇 snu13与U3 snoRNA的结构与功能研究 | 第64-99页 |
| 第四章 snu13与U3 snoRNA的研究背景 | 第64-68页 |
| 4.1 RNA修饰 | 第64页 |
| 4.2 核糖体RNA (rRNA)的生成和甲基化 | 第64-65页 |
| 4.3 RNA扭结(Kink-Turn, K-turn) | 第65页 |
| 4.4 U3 snoRNA与U3 snoRNP | 第65-68页 |
| 第五章 材料与方法 | 第68-86页 |
| 5.1 常用生物信息学工具 | 第68页 |
| 5.1.1 RNA二级结构预测工具 | 第68页 |
| 5.1.2 RNA消光系数计算工具 | 第68页 |
| 5.2 RNA转录 | 第68-83页 |
| 5.2.1 体外转录原理-起始 | 第68-69页 |
| 5.2.2 体外转录原理-终止 | 第69-70页 |
| 5.2.3 注意问题-转录不均一性和rNTPs浓度 | 第70-71页 |
| 5.2.4 全长U3转录引物设计 | 第71-72页 |
| 5.2.5 U3 box B/C和box C/D转录引物设计 | 第72-73页 |
| 5.2.6 T7 RNA聚合酶表达纯化 | 第73-74页 |
| 5.2.7 体外转录体系镁离子浓度优化 | 第74-76页 |
| 5.2.8 PAGE鉴定RNA转录情况 | 第76-78页 |
| 5.2.9 RNA转录与纯化 | 第78-83页 |
| 5.3 snu13、fibrillarin、nop56、nop56的表达纯化 | 第83-86页 |
| 5.3.1 snu13的表达纯化 | 第83页 |
| 5.3.2 fibrillarin表达纯化 | 第83-84页 |
| 5.3.3 Nop56和Nop58的表达纯化 | 第84-86页 |
| 第六章 实验结果 | 第86-99页 |
| 6.1 snu13表达、纯化 | 第86-87页 |
| 6.2 snu13 15N-1H HSQC二维谱 | 第87-88页 |
| 6.3 fibrillarin表达纯化 | 第88-90页 |
| 6.4 Nop56/Nop58表达纯化 | 第90页 |
| 6.5 fibrillarin与H2A相互作用验证 | 第90-91页 |
| 6.6 全长U3 RNA转录 | 第91-92页 |
| 6.7 U3 snoRNA与snu13相互作用 | 第92-95页 |
| 6.8 U3 box B/C在溶液中的结构 | 第95-97页 |
| 6.9 总结及展望 | 第97-99页 |
| 第三篇 CREBBP bromodomain与H3K56ac的结构与功能研究(与徐莉同学合作) | 第99-108页 |
| 第七章 CREBBP bromodomain与H3K56ac的研究背景 | 第99-101页 |
| 第八章 材料与方法 | 第101-102页 |
| 8.1 CREBBP bromodomain的克隆、表达、纯化(略) | 第101页 |
| 8.2 ASF1的克隆、表达、纯化 | 第101-102页 |
| 第九章 实验结果 | 第102-108页 |
| 9.1 ASF1的克隆、表达和纯化 | 第102页 |
| 9.2 H3K56ac小肽(44-57)滴定CREBBP bromodomain | 第102-103页 |
| 9.3 CREBBP bromodomain结合H3K56ac的H3/H4 dimer | 第103-105页 |
| 9.4 CREBBP bromodomain识别H3K56ac的作用 | 第105-106页 |
| 9.5 总结与展望 | 第106-108页 |
| 参考文献 | 第108-115页 |
| 致谢 | 第115-116页 |
| 在读期间发表的学术论文 | 第116页 |
