| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 目录 | 第7-11页 |
| 1 前言 | 第11-19页 |
| ·香蕉枯萎病及其病原菌 | 第11页 |
| ·尖孢镰刀菌的侵染过程 | 第11-12页 |
| ·附着 | 第11页 |
| ·入侵 | 第11-12页 |
| ·定殖 | 第12页 |
| ·发病 | 第12页 |
| ·信号传导在真菌致病过程中的作用 | 第12-14页 |
| ·MAPK途径 | 第13页 |
| ·G蛋白与G蛋白偶联途径 | 第13-14页 |
| ·异核体不亲和 | 第14-15页 |
| ·真菌的基因功能研究 | 第15-18页 |
| ·基因敲除 | 第15-16页 |
| ·RNA干扰 | 第16页 |
| ·超表达 | 第16页 |
| ·酵母双杂交技术 | 第16-17页 |
| ·转座子标签技术 | 第17页 |
| ·基因诱捕技术 | 第17-18页 |
| ·本研究的目的及意义 | 第18-19页 |
| 2 材料方法 | 第19-41页 |
| ·材料与仪器 | 第19-20页 |
| ·材料 | 第19-20页 |
| ·菌种与质粒 | 第19页 |
| ·药品及试剂 | 第19-20页 |
| ·引物合成与DNA测序 | 第20页 |
| ·仪器 | 第20页 |
| ·实验方法 | 第20-41页 |
| ·FOC4的活化与致病性验证 | 第20-21页 |
| ·FOC4的潮霉素抗性实验 | 第21页 |
| ·目的基因的PCR验证 | 第21-22页 |
| ·FOC4,FOC1基因组DNA的提取 | 第21页 |
| ·目的基因的PCR扩增 | 第21-22页 |
| ·目的基因的序列分析 | 第22页 |
| ·基因敲除中原生质体转化体系的确定 | 第22-25页 |
| ·含有绿色荧光蛋白基因的DNA片段的获得 | 第22-24页 |
| ·pCT74质粒的提取 | 第22-23页 |
| ·pCT74质粒的酶切及含有绿色荧光蛋白基因的DNA片段的回收 | 第23-24页 |
| ·绿色荧光蛋白基因的FOC4原生质体转化 | 第24-25页 |
| ·原生质体的制备 | 第24页 |
| ·原生质体的转化 | 第24-25页 |
| ·敲除载体构建 | 第25-35页 |
| ·FOC4B_001基因敲除载体的构建 | 第25-31页 |
| ·同源臂的克隆 | 第25-28页 |
| ·同源臂的PCR扩增 | 第25页 |
| ·同源臂的PCR扩增产物的回收 | 第25-26页 |
| ·回收产物的连接 | 第26页 |
| ·连接产物的转化 | 第26-27页 |
| ·克隆载体的筛选与鉴定 | 第27-28页 |
| ·FOC4B_001A连接至载体pCX62 | 第28-29页 |
| ·FOC4B_001A和载体pCX62线性片段的获得 | 第28-29页 |
| ·FOC4B_001A与pCX62片段的连接 | 第29页 |
| ·连接产物的转化 | 第29页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第29页 |
| ·FOC4B_001B连接至载体FOC4B_001A-pCX62 | 第29-31页 |
| ·FOC4B_001A-pCX62大片段与FOC4B_001B片段的获得 | 第30页 |
| ·回收片段的连接 | 第30页 |
| ·连接产物的转化 | 第30页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第30-31页 |
| ·FOC4B_003基因的敲除载体构建 | 第31-35页 |
| ·同源臂的克隆 | 第31-32页 |
| ·同源臂的PCR扩增 | 第31页 |
| ·PCR扩增产物的回收、连接和转化 | 第31页 |
| ·克隆载体的筛选与鉴定 | 第31-32页 |
| ·FOC4B_003A连接至载体pCT74 | 第32-33页 |
| ·FOC4B_003A与载体pCT74线性片段的获得 | 第32-33页 |
| ·FOC4B_003 A与pCT74片段的连接 | 第33页 |
| ·连接产物的转化 | 第33页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第33页 |
| ·FOC4B_003B连接至载体FOC4B_003A-pCT74 | 第33-35页 |
| ·FOC4B_003A-pCT74大片段与FOC4B_003B的获得 | 第33-34页 |
| ·回收片段的连接 | 第34页 |
| ·连接产物的转化 | 第34页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第34-35页 |
| ·敲除载体的FOC4转化 | 第35-36页 |
| ·转化片段的获得 | 第35-36页 |
| ·原生质体的制备及转化 | 第36页 |
| ·转化子的PCR鉴定 | 第36-39页 |
| ·转化子的小量DNA提取 | 第36页 |
| ·转化子的潮霉素基因PCR验证 | 第36-37页 |
| ·转化子插入片段的定点插入PCR验证 | 第37页 |
| ·转化子的基因PCR验证 | 第37-39页 |
| ·目的基因缺失突变体的表型分析 | 第39-41页 |
| ·目的基因缺失突变体菌落形态及其生长速率的测定 | 第39页 |
| ·目的基因缺失突变体的孢子形态观察 | 第39页 |
| ·目的基因缺失突变体的菌丝形态观察 | 第39页 |
| ·目的基因缺失突变体的热敏感性试验 | 第39页 |
| ·ΔFOC4B_003基因缺失突变体的绿色荧光蛋白在显微镜下的观察 | 第39页 |
| ·ΔFOC4B_003基因缺失突变体与木霉的对峙实验 | 第39-40页 |
| ·目的基因缺失突变体的致病性试验 | 第40-41页 |
| 3 结果与分析 | 第41-59页 |
| ·FOC4的致病力验证与再分离 | 第41页 |
| ·FOC4的潮霉素抗性实验 | 第41页 |
| ·目的基因的PCR验证 | 第41-42页 |
| ·基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列分析结果 | 第42-43页 |
| ·基因敲除中原生质体转化体系的确定 | 第43页 |
| ·同源臂的克隆 | 第43-45页 |
| ·FOC4B_001A-pCX62和FOC4B_003A-pCT74的酶切鉴定 | 第45页 |
| ·FOC4B_001AB-pCX62和FOC4B_003AB-pCT74的酶切鉴定 | 第45-47页 |
| ·转化片段的获得 | 第47页 |
| ·转化子的PCR验证 | 第47-52页 |
| ·目的基因缺失突变体菌落形态及其生长速率的测定 | 第52页 |
| ·目的基因缺失突变体的孢子形态,菌丝形态观察 | 第52-54页 |
| ·目的基因缺失突变体的热敏感性试验 | 第54-55页 |
| ·ΔFOC4B_003基因缺失突变体在共聚焦显微镜下的观察 | 第55页 |
| ·ΔFOC4B_003与木霉的对峙实验 | 第55-56页 |
| ·目的基因缺失突变体的致病性及入侵观察 | 第56-59页 |
| 4 讨论 | 第59-65页 |
| ·FOC4的活化与与致病性验证 | 第59页 |
| ·FOC4的潮霉素抗性实验 | 第59页 |
| ·目的基因的PCR验证 | 第59-60页 |
| ·序列分析 | 第60页 |
| ·基因敲除转化体系的确定 | 第60页 |
| ·载体骨架的选择 | 第60-61页 |
| ·同源臂的克隆 | 第61页 |
| ·同源臂的连接 | 第61-62页 |
| ·FOC4B_001-AhphB和FOC4B_003-Ahph-gfpB片段的原生质体转化 | 第62页 |
| ·FOC4转化子的PCR鉴定 | 第62页 |
| ·目的基因的缺失对FOC4菌落形态、生长速率、孢子形态、菌丝形态的影响 | 第62页 |
| ·目的基因的缺失对FOC4抗热性的影响 | 第62-63页 |
| ·ΔFOC4B_003与木霉的相互作用 | 第63-64页 |
| ·两个基因缺失突变体的致病性分析 | 第64-65页 |
| 6 结论 | 第65-66页 |
| 7 参考文献 | 第66-73页 |
| 附录1 本文所用的引物列表 | 第73-74页 |
| 致谢 | 第74页 |
