基于细胞微阵列筛选泛素—蛋白酶体通路底物的研究
| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 引言 | 第10-13页 |
| 实验整体设计图 | 第13-14页 |
| 第一部分 细胞微阵列定位体系的建立 | 第14-39页 |
| 材料与方法 | 第16-21页 |
| 1 材料 | 第16-17页 |
| ·细胞株及培养试剂 | 第16页 |
| ·菌株和质粒 | 第16页 |
| ·主要试剂 | 第16页 |
| ·主要仪器 | 第16-17页 |
| 2 实验方法 | 第17-21页 |
| ·目的蛋白质cDNA序列选取 | 第17页 |
| ·PCR扩增目的片段 | 第17-18页 |
| ·酶切PCR产物和载体 | 第18页 |
| ·片段与载体的连接 | 第18页 |
| ·大肠杆菌的转化 | 第18-19页 |
| ·质粒提取、酶切片段的鉴定 | 第19页 |
| ·玻片处理 | 第19页 |
| ·细胞微阵列制备 | 第19-20页 |
| ·细胞图像采集 | 第20-21页 |
| 结果 | 第21-38页 |
| 1.目的蛋白质cDNA序列的选取 | 第21页 |
| 2.目的基因cDNA序列的钓取及克隆 | 第21-33页 |
| 3.蛋白质表达的检测 | 第33-34页 |
| 4.细胞微阵列体系的建立 | 第34-35页 |
| 5.基于细胞微阵列的通量化蛋白质定位 | 第35-38页 |
| 小结 | 第38-39页 |
| 第二部分 泛素—蛋白酶体通路底物的筛选 | 第39-55页 |
| 材料与方法 | 第41-45页 |
| 1 材料及来源 | 第41-42页 |
| ·细胞株 | 第41页 |
| ·菌株和质粒 | 第41页 |
| ·细胞培养试剂 | 第41页 |
| ·主要试剂 | 第41页 |
| ·大型仪器 | 第41-42页 |
| 2 实验方法 | 第42-45页 |
| ·玻片处理 | 第42页 |
| ·筛选细胞微阵列的制备 | 第42-43页 |
| ·蛋白质定位观察 | 第43页 |
| ·电镜样品制备 | 第43页 |
| ·双向凝胶电泳和双向免疫印迹实验 | 第43-45页 |
| 结果 | 第45-54页 |
| 1.蛋白酶体抑制剂对蛋白质定位的影响 | 第45-50页 |
| 2.蛋白质定位变化的分类 | 第50-51页 |
| 3.与双向电泳法的比较 | 第51-54页 |
| 小结 | 第54-55页 |
| 第三部分 筛选结果的验证 | 第55-67页 |
| 材料与方法 | 第55-60页 |
| 1 材料及来源 | 第55-57页 |
| ·细胞株 | 第55页 |
| ·菌株和质粒 | 第55页 |
| ·细胞培养试剂 | 第55页 |
| ·主要试剂 | 第55-56页 |
| ·抗体 | 第56页 |
| ·大型仪器 | 第56-57页 |
| 2 实验方法 | 第57-60页 |
| ·玻片处理 | 第57页 |
| ·条件筛选细胞微阵列的制备 | 第57页 |
| ·蛋白质定位观察 | 第57页 |
| ·免疫荧光实验 | 第57-58页 |
| ·免疫印迹实验 | 第58页 |
| ·外源蛋白质泛素化实验 | 第58-59页 |
| ·内源蛋白质泛素化实验 | 第59-60页 |
| 结果 | 第60-66页 |
| 1.内源蛋白质定位变化的验证 | 第60-61页 |
| 2.蛋白质表达量变化的验证 | 第61-62页 |
| 3.蛋白质泛素化状态的验证 | 第62-64页 |
| 4.信号转导通路的筛选验证 | 第64-66页 |
| 小结 | 第66-67页 |
| 讨论 | 第67-70页 |
| 总结 | 第70-72页 |
| References | 第72-78页 |
| 致谢 | 第78-79页 |
| 附录 | 第79-81页 |
| 文章发表与交流 | 第81-91页 |
