| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-14页 |
| 第一章 绪论 | 第14-43页 |
| ·t-PA的结构与功能 | 第15-20页 |
| ·t-PA的分子结构 | 第15-16页 |
| ·t-PA的生理特性 | 第16-17页 |
| ·t-PA的作用机制 | 第17-18页 |
| ·t-PA的基因结构 | 第18-20页 |
| ·t-PA的突变体 | 第20-25页 |
| ·增强t-PA的酶原性和血纤维蛋白刺激作用 | 第21页 |
| ·提高t-PA对血栓的亲和性 | 第21-22页 |
| ·延长t-PA在体内的半衰期 | 第22-23页 |
| ·抗PAI-1抑制 | 第23-25页 |
| ·t-PA及其突变体的表达 | 第25-32页 |
| ·t-PA及其突变体在大肠杆菌中的表达 | 第25-26页 |
| ·t-PA及其突变体在哺乳动物细胞中的表达 | 第26-27页 |
| ·t-PA及其突变体在酵母细胞中的表达 | 第27-28页 |
| ·t-PA及其突变体在昆虫细胞中的表达 | 第28-29页 |
| ·t-PA及其突变体在乳腺生物反应器中的表达 | 第29-30页 |
| ·t-PA及其突变体在丝状真菌中的表达 | 第30-32页 |
| ·其它溶栓剂 | 第32-35页 |
| ·链激酶 | 第32-33页 |
| ·尿激酶 | 第33页 |
| ·对-甲氧苯甲酰纤溶酶原链激酶激活剂复合物 | 第33页 |
| ·单链尿激酶型纤溶酶原激活剂 | 第33-34页 |
| ·葡激酶 | 第34页 |
| ·吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂 | 第34页 |
| ·纳豆激酶 | 第34-35页 |
| ·本论文的立题依据及主要研究内容 | 第35-37页 |
| 参考文献 | 第37-43页 |
| 第二章 Trichoderma reesei(8)生物合成t-PA摇瓶分批发酵条件的研究 | 第43-73页 |
| ·引言 | 第43页 |
| ·材料与方法 | 第43-47页 |
| ·菌种 | 第43页 |
| ·主要仪器 | 第43页 |
| ·主要试剂 | 第43-44页 |
| ·主要溶液 | 第44页 |
| ·培养基 | 第44-45页 |
| ·实验方法 | 第45页 |
| ·分析方法 | 第45-47页 |
| ·结果与讨论 | 第47-71页 |
| ·t-PA高产菌株的分离纯化、筛选及稳定性测定 | 第47-49页 |
| ·种子培养基及种子培养条件的优化 | 第49-55页 |
| ·种子培养基中碳、氮源的确定 | 第49-50页 |
| ·种子培养基中无机离子的筛选 | 第50-52页 |
| ·Tween80对种子生长的影响 | 第52页 |
| ·种子培养时间确定 | 第52-53页 |
| ·斜面孢子接种量的影响 | 第53页 |
| ·种子培养适宜初始pH的确定 | 第53-54页 |
| ·种子培养适宜温度的选择 | 第54页 |
| ·种子培养适宜装液量和转速的确定 | 第54页 |
| ·适宜种子接种量的选择 | 第54-55页 |
| ·Trichoderma reesei(8)生物合成t-PA的代谢调节 | 第55-59页 |
| ·t-PA生物合成的诱导 | 第55-56页 |
| ·分解代谢物对t-PA生物合成的阻遏作用 | 第56-58页 |
| ·代谢产物对t-PA生物合成的反馈阻遏 | 第58-59页 |
| ·发酵培养基组成的优化 | 第59-69页 |
| ·碳源对t-PA合成的影响 | 第59-60页 |
| ·氮源对t-PA合成的影响 | 第60-61页 |
| ·发酵培养基中无机离子的筛选 | 第61-62页 |
| ·表面活性剂的选择 | 第62-63页 |
| ·响应面实验优化发酵培养基成分 | 第63-69页 |
| ·摇瓶发酵条件的优化 | 第69-71页 |
| ·适宜摇瓶发酵工艺参数的确定 | 第69-70页 |
| ·摇瓶发酵过程动力学曲线 | 第70-71页 |
| ·本章小结 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-73页 |
| 第三章 Trichoderma reesei(8)生物合成t-PA 5L罐分批发酵条件和动力学的研究 | 第73-83页 |
| ·引言 | 第73页 |
| ·材料与方法 | 第73-74页 |
| ·菌种 | 第73-74页 |
| ·主要仪器 | 第74页 |
| ·主要试剂 | 第74页 |
| ·培养基 | 第74页 |
| ·实验方法 | 第74页 |
| ·分析方法 | 第74页 |
| ·结果与讨论 | 第74-81页 |
| ·5L发酵罐分批发酵条件控制 | 第74-77页 |
| ·适宜溶氧的控制 | 第74-75页 |
| ·适宜温度的控制 | 第75-76页 |
| ·适宜pH值的控制 | 第76-77页 |
| ·5L发酵罐分批发酵过程动力学曲线 | 第77-78页 |
| ·分批发酵动力学模型的建立 | 第78-81页 |
| ·动力学模型的选择 | 第78-79页 |
| ·模型拟合分析 | 第79-81页 |
| ·本章小结 | 第81-82页 |
| 参考文献 | 第82-83页 |
| 第四章 里氏木霉重组t-PA的分离纯化及其部分性质的鉴定 | 第83-107页 |
| ·引言 | 第83-86页 |
| ·蛋白质分离纯化常用的方法和原理 | 第83-85页 |
| ·凝胶过滤色谱 | 第83页 |
| ·离子交换色谱 | 第83-84页 |
| ·反向色谱 | 第84页 |
| ·疏水作用色谱 | 第84-85页 |
| ·亲和层析 | 第85页 |
| ·本实验的目的、主要内容和基本思路 | 第85-86页 |
| ·材料与方法 | 第86-92页 |
| ·主要材料 | 第86页 |
| ·主要试剂 | 第86-87页 |
| ·主要设备 | 第87页 |
| ·主要溶液 | 第87-88页 |
| ·实验方法 | 第88-92页 |
| ·结果与讨论 | 第92-105页 |
| ·超滤浓缩 | 第92页 |
| ·硫酸铵盐析 | 第92-93页 |
| ·疏水相互作用层析 | 第93-96页 |
| ·Octyl Sepharose 4 Fast Flow | 第93-95页 |
| ·Butyl Sepharose 4 Fast Flow | 第95-96页 |
| ·Sephadex G-25凝胶过滤脱盐 | 第96页 |
| ·离子交换层析 | 第96-98页 |
| ·CM-Sepharose Fast Flow | 第96-97页 |
| ·Q-Sepharose High Performance | 第97-98页 |
| ·里氏木霉重组t-PA的纯化情况 | 第98-99页 |
| ·SDS-PAGE纤维蛋白自显影 | 第99页 |
| ·阴、阳纤维蛋白平板 | 第99-100页 |
| ·冻融次数和保存时间对酶活力的影响 | 第100-101页 |
| ·酶的温度稳定性 | 第101页 |
| ·酶的pH稳定性 | 第101-102页 |
| ·酶的最适作用温度 | 第102-103页 |
| ·酶的最适作用pH | 第103-104页 |
| ·等电点的测定 | 第104-105页 |
| ·本章小结 | 第105-106页 |
| 参考文献 | 第106-107页 |
| 第五章 r-PA基因的克隆及测序 | 第107-126页 |
| ·引言 | 第107-108页 |
| ·材料与方法 | 第108-115页 |
| ·菌株与质粒 | 第108页 |
| ·引物 | 第108页 |
| ·培养基 | 第108页 |
| ·主要试剂 | 第108-109页 |
| ·主要设备 | 第109页 |
| ·主要溶液 | 第109-110页 |
| ·实验方法 | 第110-115页 |
| ·结果与讨论 | 第115-124页 |
| ·基因工程菌里氏木霉染色体DNA的提取 | 第115-117页 |
| ·DNA提取方法的比较 | 第115-116页 |
| ·冷冻研磨CTAB法最佳条件的确定 | 第116-117页 |
| ·r-PA cDNA的克隆 | 第117-120页 |
| ·PCR扩增r-PA cDNA | 第117-118页 |
| ·重组质粒pMD18-r-PA的构建及筛选 | 第118页 |
| ·重组质粒pMD18-r-PA的鉴定 | 第118-120页 |
| ·r-PA cDNA序列的测定 | 第120-124页 |
| ·本章小结 | 第124页 |
| 参考文献 | 第124-126页 |
| 第六章 r-PA基因表达载体的构建及其在甲醇毕赤酵母中的表达 | 第126-143页 |
| ·引言 | 第126页 |
| ·材料与方法 | 第126-131页 |
| ·菌株与质粒 | 第126页 |
| ·培养基 | 第126-127页 |
| ·主要试剂 | 第127页 |
| ·主要设备 | 第127页 |
| ·主要溶液 | 第127-128页 |
| ·实验方法 | 第128-131页 |
| ·结果与讨论 | 第131-141页 |
| ·r-PA基因表达载体的构建 | 第131-135页 |
| ·质粒的双酶切 | 第131-133页 |
| ·重组表达载体的连接、转化和筛选 | 第133页 |
| ·pMETαA-r-PA的鉴定 | 第133-135页 |
| ·电转化甲醇毕赤酵母 | 第135-137页 |
| ·重组质粒pMETαA-r-PA的线性化 | 第135-136页 |
| ·甲醇毕赤酵母PMAD16的生长曲线 | 第136-137页 |
| ·电转化甲醇毕赤酵母电场强度的选择 | 第137页 |
| ·酵母转化子的筛选及鉴定 | 第137-139页 |
| ·酵母转化子的筛选 | 第137-138页 |
| ·酵母转化子的PCR鉴定 | 第138页 |
| ·酵母转化子表型的鉴定 | 第138-139页 |
| ·基因工程菌株PMAD16-r-PA的生长曲线的测定 | 第139-140页 |
| ·r-PA的诱导表达 | 第140-141页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE法检测 | 第141页 |
| ·本章小结 | 第141-142页 |
| 参考文献 | 第142-143页 |
| 第七章 全文总结与展望 | 第143-148页 |
| ·全文总结 | 第143-146页 |
| ·本论文的创新点 | 第146-147页 |
| ·展望 | 第147-148页 |
| 致谢 | 第148-149页 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 | 第149页 |
