| 摘要 | 第1-11页 |
| ABSTRACT | 第11-15页 |
| 第一部分 文献综述 | 第15-50页 |
| 1 猪圆环病毒的一般生物学特征 | 第15-17页 |
| ·猪圆环病毒的发现和分类 | 第15-16页 |
| ·PCV的形态和理化特性 | 第16-17页 |
| ·PCV的体外培养特性 | 第17页 |
| 2 猪圆环病毒的分子生物学特征 | 第17-21页 |
| ·PCV2分子特征和主要元件 | 第17-20页 |
| ·PCV2毒株的遗传进化分析 | 第20-21页 |
| 3 PCV的复制与转录 | 第21-23页 |
| 4 PCV2感染性克隆技术的研究进展及其在疫苗开发中的应用 | 第23-24页 |
| 5 PCV2感染及其相关疾病的研究进展 | 第24-34页 |
| ·PCV2相关疾病的研究 | 第24-27页 |
| ·断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS) | 第27-29页 |
| ·PCV2的感染和致病机理 | 第29-31页 |
| ·PCV2的感染 | 第29-30页 |
| ·PCV2的致病机理 | 第30-31页 |
| ·PCV2的流行病学研究 | 第31-34页 |
| 6 PCV2的检测 | 第34-37页 |
| ·酶联免疫吸附试验(ELISA) | 第34-35页 |
| ·免疫组化试验(IHC) | 第35页 |
| ·间接免疫荧光(IFA) | 第35页 |
| ·PCR技术 | 第35-36页 |
| ·核酸杂交技术 | 第36页 |
| ·限制性长度多态性分析(RFLP) | 第36-37页 |
| 参考文献 | 第37-50页 |
| 第二部分 研究内容 | 第50-131页 |
| 第一章 浙江省及周边省市PCV2分子流行病学调查及病毒的分离鉴定 | 第51-71页 |
| 1.材料与方法 | 第52-57页 |
| ·细胞、载体与试剂 | 第52页 |
| ·病料采集 | 第52页 |
| ·病毒DNA提取 | 第52-53页 |
| ·PCV2特异性检测引物的设计及病料中PCV2的检测 | 第53页 |
| ·不同地区、不同时间PCV2毒株ORF2的扩增和测序 | 第53-55页 |
| ·PCR产物纯化 | 第53-54页 |
| ·连接 | 第54页 |
| ·CaCl2法制备E.coli DH5α感受态细胞 | 第54-55页 |
| ·转化 | 第55页 |
| ·碱裂解法抽提质粒 | 第55页 |
| ·重组质粒鉴定和测序 | 第55页 |
| ·PCV2病毒分离 | 第55-56页 |
| ·PCV2分离株的PCR和间接免疫荧光(IFA)鉴定 | 第56页 |
| ·分离毒株全基因组扩增、克隆和测序 | 第56-57页 |
| ·病毒纯化及形态观察 | 第57页 |
| ·序列分析 | 第57页 |
| 2.结果分析 | 第57-67页 |
| ·病理学变化观察 | 第57-58页 |
| ·组织病料中PCV2的PCR检测结果 | 第58-59页 |
| ·不同地区、不同时间PCV2毒株的ORF2序列分析 | 第59-64页 |
| ·PCV2的分离和鉴定 | 第64页 |
| ·PCV2分离株全基因组序列分析 | 第64-66页 |
| ·病毒纯化 | 第66-67页 |
| 3.讨论 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-71页 |
| 第二章 浙江省及周边省市PCV2感染的血清学调查 | 第71-82页 |
| 1.材料与方法 | 第72-75页 |
| ·细胞、载体与试剂 | 第72页 |
| ·猪血清样品采集 | 第72页 |
| ·PCV2和PCV1 ORF2蛋白的表达纯化 | 第72-73页 |
| ·多抗的制备 | 第73页 |
| ·融合蛋白Cap2s和Capls免疫反应性分析 | 第73-74页 |
| ·IFA鉴定多抗的反应性和特异性 | 第74页 |
| ·猪血清样品中PCV2抗体ELISA检测方法的建立 | 第74-75页 |
| ·浙江省及周边省市猪群PCV2感染的血清流行病学调查 | 第75页 |
| 2.结果 | 第75-78页 |
| ·PCV2 ORF2蛋白和PCV1 ORF2蛋白的表达纯化 | 第75-76页 |
| ·纯化蛋白Western blot鉴定 | 第76-77页 |
| ·PCV1和PCV2兔多抗特性的IFA鉴定 | 第77页 |
| ·PCV2抗体ELISA检测方法的建立 | 第77-78页 |
| ·浙江省及周边省市猪群PCV2血清流行病学调查 | 第78页 |
| 3.讨论 | 第78-80页 |
| 参考文献 | 第80-82页 |
| 第三章 猪圆环病毒1型ORF2蛋白核定位信号原件的定位 | 第82-97页 |
| 1.材料与方法 | 第83-89页 |
| ·载体与试剂 | 第83页 |
| ·细胞及病毒 | 第83页 |
| ·病毒DNA抽提 | 第83-84页 |
| ·重组真核表达质粒的构建 | 第84-87页 |
| ·PCR扩增产物的磷酸化处理 | 第87页 |
| ·转染级别超纯质粒的抽提 | 第87-88页 |
| ·细胞转染及荧光观察 | 第88-89页 |
| ·各融合基因在转染细胞内的转录分析 | 第89页 |
| 2.结果分析 | 第89-93页 |
| ·重组表达质粒的构建及转染级别质粒的抽提 | 第89页 |
| ·IFA鉴定PCV1感染细胞中病毒核衣壳蛋白的定位 | 第89-90页 |
| ·PCV1 ORF2及其截断序列与EGFP融合表达产物的细胞定位 | 第90-91页 |
| ·PCV1 ORF2蛋白中核定位信号元件的分析和确定 | 第91-93页 |
| 3.讨论 | 第93-94页 |
| 参考文献 | 第94-97页 |
| 第四章 PCV1、PCV2及其突变体感染性克隆的构建和体外复制能力研究 | 第97-114页 |
| 1.材料与方法 | 第98-104页 |
| ·细胞和病毒 | 第98页 |
| ·工具酶和试剂 | 第98-99页 |
| ·引物设计和感染性克隆的构建 | 第99-102页 |
| ·高纯质粒抽提和细胞转染及检测 | 第102-103页 |
| ·体外感染稳定性实验和TCID50测定 | 第103页 |
| ·体外复制能力比较试验 | 第103页 |
| ·Real-time PCR体系的建立 | 第103-104页 |
| 2.结果 | 第104-108页 |
| ·感染性克隆的构建和鉴定 | 第104页 |
| ·Real-time PCR体系的建立 | 第104-105页 |
| ·各感染性克隆转染PK-15细胞后能形成具有感染性的病毒粒子 | 第105-106页 |
| ·重组病毒体外感染稳定性实验 | 第106-107页 |
| ·各感染性克隆体外生长能力比较 | 第107-108页 |
| 3.讨论 | 第108-110页 |
| 参考文献 | 第110-114页 |
| 第五章 重组病毒对BALB/C小鼠的致病性和免疫原性比较 | 第114-131页 |
| 1. 材料与方法 | 第115-118页 |
| ·细胞、病毒、动物和试剂 | 第115-116页 |
| ·重组病毒体外传代和增殖 | 第116页 |
| ·试验设计和攻毒 | 第116页 |
| ·病理学与组织病理学观察 | 第116-117页 |
| ·病毒血症的检测 | 第117页 |
| ·血清学鉴定及其抗体消长规律分析 | 第117-118页 |
| ·小鼠外周血林把细胞CD3~+、CD4~+、CD8~+亚群分析 | 第118页 |
| 2.结果 | 第118-126页 |
| ·试验小鼠的组织病理学观察 | 第118-120页 |
| ·小鼠体内病毒特异性抗体的血清学分析 | 第120-122页 |
| ·病毒血症检测 | 第122-123页 |
| ·小鼠外周血CD4~+、CD8~+T淋巴细胞亚群测定 | 第123-126页 |
| 3.讨论 | 第126-128页 |
| 参考文献 | 第128-131页 |
| 结论与展望 | 第131-132页 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 | 第132-133页 |
| 致谢 | 第133页 |
