| 摘要 | 第1-8页 |
| ABSTRACT | 第8-14页 |
| 缩略词表 | 第14-16页 |
| 第一部分 文献综述 | 第16-38页 |
| 综述一 生物反应器研究进展简介 | 第17-31页 |
| 1 基因工程菌作为反应器研究进展 | 第17-18页 |
| 2 酵母生物反应器生产重组蛋白 | 第18页 |
| 3 昆虫细胞作为生物反应器生产重组蛋白 | 第18-20页 |
| 4 转基因禽类生物反应器 | 第20页 |
| 5 哺乳动物乳腺生物反应器 | 第20-31页 |
| ·哺乳动物乳腺生物反应器原理及应用 | 第21-25页 |
| ·转基因乳腺生物反应器的载体与方法 | 第25-31页 |
| 综述二 胶原蛋白研究概况 | 第31-38页 |
| 1 胶原蛋白的分布 | 第31页 |
| 2 胶原蛋白的分类 | 第31-32页 |
| 3 胶原的结构 | 第32-33页 |
| 4 胶原蛋白的生物合成 | 第33-35页 |
| 5 Ⅰ型胶原的功能与应用 | 第35-36页 |
| 6 胶原蛋白的制备方法 | 第36-37页 |
| 7 乳腺表达重组胶原蛋白的研究进展 | 第37-38页 |
| 第二部分 实验部分 | 第38-102页 |
| 实验一 人Ⅰ型A1胶原CDNA基因乳腺特异表达载体的构建 | 第39-53页 |
| 1 材料与方法 | 第39-47页 |
| ·实验材料 | 第39-40页 |
| ·RNA的分离提取 | 第40-41页 |
| ·胶原α1链cDNA的反转录合成与扩增 | 第41-42页 |
| ·人Ⅰ型α1胶原cDNA基因克隆载体的构建与基因测序 | 第42-43页 |
| ·pET-44a(+)-COL1α1 cDNA重组质粒的构建 | 第43-45页 |
| ·乳腺特异性表达载体引入胶原蛋白cDNA和6×His标签 | 第45-46页 |
| ·乳腺特异性表达载体引入加强型绿色荧光蛋白(EGFP)和新霉素抗性(Neo~r)双标记基因 | 第46-47页 |
| ·质粒载体pBC1-COL1α1-EGFP-Neo~r的DNA鉴定 | 第47页 |
| 2 结果与分析 | 第47-51页 |
| ·人Ⅰ型α1胶原cDNA基因的测序结果 | 第47-50页 |
| ·载体pBC1-COL1α1-EGFP-Neo~r的DNA鉴定 | 第50-51页 |
| 3 讨论 | 第51-53页 |
| 实验二 牛成纤维细胞系的建立及转基因条件的优化 | 第53-63页 |
| 1 材料与方法 | 第53-56页 |
| ·实验材料 | 第53-54页 |
| ·牛成纤维细胞系的建立 | 第54页 |
| ·荷斯坦奶牛耳成纤维细胞对G418耐受实验 | 第54-55页 |
| ·人Ⅰ型胶原基因真核表达质粒的细胞转染 | 第55页 |
| ·早期转染细胞的形态观察和表达效率 | 第55-56页 |
| ·阳性克隆的筛选纯化与放大培养 | 第56页 |
| ·阳性克隆细胞的生长曲线 | 第56页 |
| 2. 结果与分析 | 第56-59页 |
| ·成纤维细胞的生长 | 第57页 |
| ·荷斯坦奶牛耳成纤维细胞对G418耐受曲线 | 第57-58页 |
| ·质粒的用量与转染效果 | 第58页 |
| ·阳性克隆的筛选纯化与放大培养 | 第58-59页 |
| ·转基因细胞的生长曲线 | 第59页 |
| 3 讨论 | 第59-63页 |
| ·成纤维细胞系的建立 | 第59-60页 |
| ·双标记的筛选 | 第60-61页 |
| ·DNA用量对脂质体转染效果的影响 | 第61页 |
| ·转基因细胞的纯化 | 第61页 |
| ·转基因细胞的生长曲线 | 第61页 |
| ·转基因细胞筛选的注意事项 | 第61-63页 |
| 实验三 牛卵丘细胞系的建立及转染质粒DNA的效果分析 | 第63-72页 |
| 1 材料与方法 | 第63-66页 |
| ·实验材料 | 第63页 |
| ·牛卵丘细胞系的建立与观察 | 第63-64页 |
| ·牛卵丘细胞的生长曲线 | 第64页 |
| ·牛卵丘细胞转染质粒载体pMSCV-EGFP-Neo~r和pBC1-COL1α1-EGFP-Neo~r | 第64-65页 |
| ·阳性细胞形态观察和表达效率的分析 | 第65页 |
| ·牛卵丘细胞对G418的耐受实验 | 第65页 |
| ·阳性克隆的筛选与扩大 | 第65-66页 |
| 2 结果与分析 | 第66-69页 |
| ·细胞的形态观察与生长曲线 | 第66-67页 |
| ·转染细胞的早期观察与效率分析 | 第67-68页 |
| ·阳性克隆的筛选与扩大 | 第68-69页 |
| 3 讨论 | 第69-72页 |
| ·卵丘细胞的生长 | 第69页 |
| ·阳离子脂质体介导基因转移的机制 | 第69-71页 |
| ·两种质粒的转染效果 | 第71-72页 |
| 实验四 牛输卵管上皮细胞的培养与转基因研究 | 第72-82页 |
| 1 材料与方法 | 第72-75页 |
| ·实验材料 | 第72-73页 |
| ·奶牛输卵管上皮细胞系的建立 | 第73页 |
| ·输卵管上皮细胞的生长曲线 | 第73页 |
| ·脂质体介导的输卵管上皮细胞的转染 | 第73-74页 |
| ·电穿孔法介导的输卵上皮细胞的转染 | 第74-75页 |
| ·转基因细胞的筛选和扩大 | 第75页 |
| 2 结果与分析 | 第75-80页 |
| ·细胞的生长观察 | 第75-77页 |
| ·输卵管上皮细胞对低渗缓冲液的耐受 | 第77-78页 |
| ·输卵管上皮细胞的电穿孔效率研究 | 第78-79页 |
| ·转基因细胞的筛选和扩大 | 第79-80页 |
| 3 讨论 | 第80-82页 |
| 实验五奶牛体外培养细胞的凋亡趋势 | 第82-91页 |
| 1 材料与方法 | 第82-84页 |
| ·实验材料 | 第82-83页 |
| ·体外培养细胞系的建立 | 第83页 |
| ·输卵管上皮细胞不同培养时段细胞的早期凋亡 | 第83-84页 |
| ·体外培养不同类型体细胞的早期凋亡趋势 | 第84页 |
| ·膜联蛋白V-FITC标记法定量检测细胞早期调亡的解读 | 第84页 |
| 2 结果与分析 | 第84-87页 |
| ·泌乳期牛乳腺上皮细胞系的纯化 | 第84-86页 |
| ·输卵管上皮细胞不同生长阶段早期凋亡 | 第86-87页 |
| ·体外培养不同类型体细胞的早期凋亡趋势 | 第87页 |
| 3 讨论 | 第87-91页 |
| ·细胞凋亡引起的细胞变化 | 第88-89页 |
| ·细胞凋亡的早期检测 | 第89-91页 |
| 实验六体细胞转基因核移植胚胎发育的研究 | 第91-102页 |
| 1 材料与方法 | 第91-95页 |
| ·实验材料 | 第91-92页 |
| ·卵母细胞的体外成熟培养(IVM) | 第92-93页 |
| ·转基因阳性供体细胞和非转基因供体细胞的准备 | 第93页 |
| ·核移植(NT) | 第93-94页 |
| ·电融合 | 第94-95页 |
| ·重构胚的激活与体外培养(IVC) | 第95页 |
| ·实验设计 | 第95页 |
| ·统计分析 | 第95页 |
| ·阳性核移植胚胎的PCR扩增鉴定 | 第95页 |
| 2 结果 | 第95-99页 |
| ·转基因成纤维细胞不同克隆系之间核移植胚胎的发育 | 第96页 |
| ·供体细胞转基因对核移植胚胎发育的影响 | 第96-97页 |
| ·不同类型细胞转基因后核移植胚胎发育的比较 | 第97-99页 |
| 3 讨论 | 第99-102页 |
| 总结与展望 | 第102-103页 |
| 主要创新点 | 第103-104页 |
| 参考文献 | 第104-120页 |
| 附录 | 第120-130页 |
| 致谢 | 第130-131页 |
| 作者简介 | 第131-134页 |
| 导师评阅表 | 第134页 |
