| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-11页 |
| 第1章 综述与导言 | 第11-18页 |
| ·抗菌肽的研究进展 | 第11-14页 |
| ·抗菌肽的特点与理化性质 | 第11-12页 |
| ·抗菌肽的分类 | 第12页 |
| ·抗菌肽的杀菌作用及抑菌机制 | 第12-13页 |
| ·抗菌肽的应用前景 | 第13-14页 |
| ·天蚕素Cecropin P1 | 第14页 |
| ·Cecropin P1的性质 | 第14页 |
| ·Cecropin P1的抗菌机理 | 第14页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第14-17页 |
| ·斯德毕赤酵母的概述 | 第14-15页 |
| ·毕赤酵母表达载体 | 第15-16页 |
| ·毕赤酵母系统的应用前景 | 第16-17页 |
| ·课题研究意义与工作目标 | 第17-18页 |
| ·研究意义 | 第17页 |
| ·工作目标 | 第17-18页 |
| 第2章 原理与流程 | 第18-27页 |
| ·实验原理 | 第18-26页 |
| ·密码子优化 | 第18页 |
| ·聚合酶链式反应(PCR) | 第18-20页 |
| ·重组DNA分子的转化 | 第20页 |
| ·DNA的制备方法 | 第20-21页 |
| ·Fast Seamless Cloning技术 | 第21-22页 |
| ·外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达 | 第22-25页 |
| ·蛋白质沉淀 | 第25页 |
| ·蛋白质提取和纯化技术 | 第25-26页 |
| ·实验设计与流程 | 第26-27页 |
| 第3章 材料与方法 | 第27-45页 |
| ·材料与仪器 | 第27-34页 |
| ·化学试剂与生物试剂 | 第27-28页 |
| ·培养基 | 第28-30页 |
| ·缓冲液 | 第30-32页 |
| ·菌种 | 第32-33页 |
| ·载体质粒 | 第33页 |
| ·实验仪器与设备 | 第33-34页 |
| ·微生物学方法 | 第34-35页 |
| ·细菌培养条件 | 第34页 |
| ·菌种的保藏 | 第34-35页 |
| ·遗传学方法 | 第35-36页 |
| ·短期用量大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第35页 |
| ·大肠杆菌的转化(Ca~(2+)转) | 第35页 |
| ·毕赤酵母感受态细胞的制备以及电穿孔转化 | 第35-36页 |
| ·Mut+和Muts表型筛选 | 第36页 |
| ·分子生物学方法 | 第36-40页 |
| ·大肠杆菌中质粒DNA的抽提 | 第36-38页 |
| ·毕赤酵母基因组的提取 | 第38页 |
| ·DNA的酶切 | 第38页 |
| ·DNA的沉淀 | 第38页 |
| ·DNA的琼脂糖凝胶电泳 | 第38-39页 |
| ·DNA的琼脂糖凝胶回收(Kit法) | 第39页 |
| ·DOC-TCA蛋白质浓缩法 | 第39-40页 |
| ·Tricine-SDS-PAGE | 第40页 |
| ·非变性条件Ni-NTA-Agarose His-Tag蛋白纯化 | 第40-42页 |
| ·样品准备 | 第40-41页 |
| ·亲和层析 | 第41页 |
| ·溶液配制 | 第41页 |
| ·Ni-NTA树脂的再生 | 第41-42页 |
| ·蛋白质浓度的测定 | 第42-43页 |
| ·试剂的配制 | 第42页 |
| ·操作步骤 | 第42-43页 |
| ·透析袋的处理与样品蛋白的浓缩 | 第43页 |
| ·薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法 | 第43页 |
| ·实验中涉及的生物学软件 | 第43-45页 |
| 第4章 结果与分析 | 第45-71页 |
| ·Cecropin P1基因的合成 | 第45-47页 |
| ·Cecropin P1重组表达质粒的构建 | 第47-53页 |
| ·毕赤酵母的电穿孔转化与整合子的高抗性筛选 | 第53-54页 |
| ·整合子的Mut表型筛选 | 第54-55页 |
| ·重组毕赤酵母的PCR鉴定 | 第55-58页 |
| ·Cecropin P1在毕赤酵母X-33中的表达 | 第58-61页 |
| ·pPICZαB-Cecropin P1-1/X-33与pPICZαB-Cecropin P1-2/X-33的表达 | 第58-60页 |
| ·pGAPZαA-Cecropin P1-1/X-33与pGAPZαA-Cecropin P1-2/X-33的表达 | 第60-61页 |
| ·Cecropin P1的分离纯化与浓度测定 | 第61-65页 |
| ·pPICZαB-Cecropin P1-1/X-33和pGAPZαA-Cecropin P1-1/X-33表达蛋白浓度测定 | 第61-63页 |
| ·pPICZαB-Cecropin P1-2/X-33和pGAPZαA-Cecropin P1-2/X-33的纯化与浓度测定 | 第63-65页 |
| ·Cecropin P1的活性检测 | 第65-71页 |
| ·Cecropin P1的初步活性测定 | 第66-68页 |
| ·Cecropin P1的进一步活性检测 | 第68-71页 |
| 第5章 讨论 | 第71-81页 |
| ·Cecropin P1在毕赤酵母中表达量与活性大小 | 第71-72页 |
| ·C-末端融合标签对抗菌肽活性的影响 | 第72-73页 |
| ·抗菌肽N-端与C-端结构特征对其功能活性的影响 | 第73页 |
| ·毕赤酵母表达系统的蛋白酶降解问题 | 第73-74页 |
| ·Cecropin P1在毕赤酵母系统中表达的优势与局限性 | 第74-75页 |
| ·实验中若干问题的探讨 | 第75-79页 |
| ·用于PCR鉴定的毕赤酵母基因组制备方法 | 第75页 |
| ·用于PCR鉴定的染色体模板浓度的确定 | 第75-76页 |
| ·10kD以下的小分子蛋白电泳方法探索 | 第76-77页 |
| ·基因剂量对抗菌肽Cecropin P1在毕赤酵母中分泌表达量的影响 | 第77-78页 |
| ·培养基的PH值对重组蛋白表达的影响 | 第78-79页 |
| ·抗菌肽作为饲料添加剂的前景展望 | 第79-81页 |
| 结论 | 第81-82页 |
| 参考文献 | 第82-86页 |
| 致谢 | 第86页 |
