| 摘要 | 第4-6页 |
| abstract | 第6-7页 |
| 第1章 引言 | 第11-23页 |
| 1.1 细胞自噬的发生过程及分子机制 | 第11-15页 |
| 1.1.1 细胞自噬简介 | 第11页 |
| 1.1.2 细胞自噬的发生过程 | 第11-12页 |
| 1.1.3 细胞自噬的标志物 | 第12页 |
| 1.1.4 自噬核心机制的主要成员含有LIR基序 | 第12-13页 |
| 1.1.5 具有LIR基序的蛋白参与自噬体及其他囊泡的形成 | 第13-15页 |
| 1.1.6 具有LIR基序的蛋白作为选择性自噬的底物 | 第15页 |
| 1.2 细胞自噬的分子调控机制 | 第15-16页 |
| 1.2.1 mTOR信号通路磷酸化途径 | 第15页 |
| 1.2.2 类泛素化修饰途径 | 第15-16页 |
| 1.2.3 蛋白乙酰化调控途径 | 第16页 |
| 1.3 细胞自噬的生理功能及与疾病的关系 | 第16-17页 |
| 1.3.1 细胞自噬的生理功能 | 第16页 |
| 1.3.2 细胞自噬的异常与疾病 | 第16-17页 |
| 1.4 细胞自噬小分子抑制剂的研发进展 | 第17-18页 |
| 1.4.1 Vps34 及其复合体的小分子抑制剂 | 第17页 |
| 1.4.2 ULK1 小分子抑制剂 | 第17-18页 |
| 1.4.3 ATG4B小分子抑制剂 | 第18页 |
| 1.5 细胞自噬小分子抑制剂在肿瘤治疗中的应用前景 | 第18-23页 |
| 1.5.1 细胞自噬抑制肿瘤的发生 | 第19-20页 |
| 1.5.2 细胞自噬促进肿瘤的进展 | 第20页 |
| 1.5.3 细胞自噬抑制剂应用于肿瘤的临床试验 | 第20-22页 |
| 1.5.4 细胞自噬抑制剂用于肿瘤微环境调控 | 第22-23页 |
| 第2章 基于荧光偏振的LC3B-LIR相互作用抑制剂高通量筛选体系的建立 | 第23-41页 |
| 2.1 引言 | 第23-29页 |
| 2.2 实验方法 | 第29-33页 |
| 2.2.1 GST-LC3B(1-125)的载体构建、蛋白表达与纯化 | 第29-30页 |
| 2.2.2 多肽设计 | 第30-31页 |
| 2.2.3 多肽合成 | 第31-32页 |
| 2.2.4 基于荧光偏振(FP)的高通量筛选平台的建立及优化 | 第32-33页 |
| 2.2.5 等温滴定量热实验(ITC)验证FP体系的可靠性 | 第33页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第33-39页 |
| 2.3.1 示踪多肽的确定 | 第33-34页 |
| 2.3.2 GST-LC3B(1-125)浓度的确定 | 第34-35页 |
| 2.3.3 反应体系的优化结果 | 第35-36页 |
| 2.3.4 FP竞争实验检测LBP2与GST-LC3B的亲和力的可靠性 | 第36-38页 |
| 2.3.5 Z-factor的测定验证FP高通量筛选体系的高度稳定性 | 第38-39页 |
| 2.4 结论 | 第39-41页 |
| 第3章 靶向LC3B-LIR相互作用界面小分子抑制剂的发现、确证和机制研究 | 第41-77页 |
| 3.1 引言 | 第41-43页 |
| 3.2 实验方法 | 第43-52页 |
| 3.2.1 虚拟筛选 | 第43-44页 |
| 3.2.2 载体构建、蛋白表达与纯化 | 第44-47页 |
| 3.2.3 基于荧光偏振的高通量筛选 | 第47页 |
| 3.2.4 虚拟筛选以及基于荧光偏振初筛化合物的合并及复筛 | 第47页 |
| 3.2.5 差式扫描荧光法结合实验(Differential Scanning Fluorimetry,DSF) | 第47-48页 |
| 3.2.6 二维核磁实验 | 第48页 |
| 3.2.7 蛋白质质谱实验 | 第48-49页 |
| 3.2.8 晶体培养 | 第49页 |
| 3.2.9 晶体结构数据解析 | 第49页 |
| 3.2.10 细胞培养及稳定转染或敲减细胞株的建立 | 第49-50页 |
| 3.2.11 胞内蛋白热迁移实验(Cellular Thermal Shift Assay,CETSA) . | 第50页 |
| 3.2.12 EGFP-LC3B蛋白纯化 | 第50页 |
| 3.2.13 免疫印迹实验 | 第50-51页 |
| 3.2.14 Pull-down 实验 | 第51页 |
| 3.2.15 免疫荧光染色与共聚焦拍照 | 第51-52页 |
| 3.2.16 化学合成 | 第52页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第52-74页 |
| 3.3.1 虚拟筛选 | 第52-53页 |
| 3.3.2 基于荧光偏振的高通量筛选 | 第53页 |
| 3.3.3 初步筛选得到多个候选化合物 | 第53-54页 |
| 3.3.4 候选化合物的骨架确证 | 第54-55页 |
| 3.3.5 化合物与LC3B的结合确证 | 第55-57页 |
| 3.3.6 化合物与LC3B的结合模式分析 | 第57-60页 |
| 3.3.7 化合物的选择性分析 | 第60-63页 |
| 3.3.7.1 化合物对LC3B赖氨酸的选择性分析 | 第60-62页 |
| 3.3.7.2 化合物在LC3B同源家族蛋白间的选择性 | 第62-63页 |
| 3.3.8 细胞内确证化合物与干扰LC3与LIR的相互作用 | 第63-70页 |
| 3.3.8.1 自噬研究工具细胞系的建立 | 第63页 |
| 3.3.8.2 化合物特异性结合细胞内LC3B并修饰K49 氨基酸残基 | 第63-64页 |
| 3.3.8.3 Pull-down和免疫共沉淀实验验证化合物干扰LC3 与含LIR蛋白的相互作用 | 第64-65页 |
| 3.3.8.4 化合物破坏LC3B与自噬上游LIR蛋白的相互作用 | 第65-70页 |
| 3.3.9 化合物抑制细胞自噬的发生 | 第70-71页 |
| 3.3.10 细胞内确证化合物抑制LC3-I型向LC3-II型的转变 | 第71-73页 |
| 3.3.11 细胞内确证化合物抑制ATG4B对 LC3B的剪切 | 第73-74页 |
| 3.4 小结 | 第74-77页 |
| 3.4.1 突破与意义 | 第74-75页 |
| 3.4.2 展望 | 第75-77页 |
| 第4章 靶向细胞自噬蛋白ATG4B小分子抑制剂的发现、确证和机制研究 | 第77-99页 |
| 4.1 引言 | 第77-80页 |
| 4.2 实验方法 | 第80-86页 |
| 4.2.1 载体构建、蛋白表达与纯化 | 第80-84页 |
| 4.2.2 基于均相时间分辨荧光的高通量筛选体系建立 | 第84-85页 |
| 4.2.3 差式扫描荧光法结合实验(Differential Scanning Fluorimetry,DSF) | 第85页 |
| 4.2.4 基于SDS-PAGE的体外酶活方法测试与优化 | 第85-86页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第86-97页 |
| 4.3.1 ATG4B蛋白的表达纯化及验证 | 第86页 |
| 4.3.2 His-LC3B-GST融合蛋白的表达纯化 | 第86-87页 |
| 4.3.3 均相时间分辨荧光高通量筛选方法的建立及优化 | 第87-88页 |
| 4.3.4 287-B03 系列化合物小分子抑制剂的发现及确证 | 第88-94页 |
| 4.3.5 305-H11 系列化合物小分子抑制剂的发现、确证及机制研究 | 第94-97页 |
| 4.4 小结 | 第97-99页 |
| 全文总结 | 第99-101页 |
| 参考文献 | 第101-119页 |
| 致谢 | 第119-121页 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 | 第121-122页 |
