| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 符号说明 | 第8-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-22页 |
| 1 葡萄糖淀粉酶与GH15、GH97家族 | 第12-14页 |
| 1.1 葡萄糖淀粉酶 | 第12页 |
| 1.2 高温葡萄糖淀粉酶的应用及研究现状 | 第12-13页 |
| 1.3 GH15和GH97家族 | 第13-14页 |
| 2 Ⅱ型普鲁兰糖酶与GH57家族 | 第14-15页 |
| 2.1 Ⅱ型普鲁兰糖酶 | 第14页 |
| 2.2 GH57家族 | 第14-15页 |
| 2.2.1 GH57家族酶的种类 | 第14-15页 |
| 2.2.2 GH57家族的蛋白序列特征 | 第15页 |
| 3 Ⅱ型普鲁兰糖酶与葡萄糖淀粉酶的区别 | 第15-16页 |
| 4 α-淀粉酶 | 第16-17页 |
| 4.1 α-淀粉酶简介 | 第16-17页 |
| 4.2 高温酸性α-淀粉酶应用及研究现状 | 第17页 |
| 5 嗜热酶的筛选策略 | 第17-18页 |
| 5.1 筛选酶的常规方法 | 第17-18页 |
| 5.2 从糖苷水解酶数据库中筛选嗜热酶的方法 | 第18页 |
| 6 研究意义、目的及研究内容 | 第18-22页 |
| 6.1 研究意义 | 第18-19页 |
| 6.2 研究目的 | 第19页 |
| 6.3 研究内容 | 第19-22页 |
| 6.3.1 来源于T.minervae嗜热葡萄糖淀粉酶的克隆表达及酶学性质的测定 | 第19页 |
| 6.3.2 GH13家族来源于Acidilobus sp.7A的假定α-淀粉酶的筛选以及克隆表达 | 第19-22页 |
| 第二章 来源于T.minervae嗜热葡萄糖淀粉酶的克隆表达及酶学性质的研究 | 第22-50页 |
| 1 实验材料 | 第22-24页 |
| 1.1 蛋白序列来源 | 第22页 |
| 1.2 菌株及载体 | 第22页 |
| 1.3 生物信息学分析软件与网址 | 第22-23页 |
| 1.4 实验仪器 | 第23页 |
| 1.5 实验试剂 | 第23页 |
| 1.6 培养基及试剂的配方 | 第23-24页 |
| 2 实验方法 | 第24-33页 |
| 2.1 生物信息学分析 | 第24-25页 |
| 2.1.1 蛋白序列的获取 | 第24页 |
| 2.1.2 GA-Themi与GH57家族5种酶的保守位点分析 | 第24-25页 |
| 2.1.3 GA-Themi与GH57家族蛋白序列系统进化树的构建 | 第25页 |
| 2.1.4 GA-Themi的信号肽分析 | 第25页 |
| 2.1.5 ga-themi目的基因的获取 | 第25页 |
| 2.2 葡萄糖淀粉酶(GA-themi)重组表达菌株的构建 | 第25-27页 |
| 2.2.1 琼脂糖凝胶电泳 | 第25页 |
| 2.2.2 ga-themi目的基因片段的获取 | 第25-26页 |
| 2.2.3 pET28a质粒片段的获取 | 第26页 |
| 2.2.4 目的片段(ga-themi)与pET28a载体连接 | 第26页 |
| 2.2.5 重组表达质粒的转化 | 第26-27页 |
| 2.3 葡萄糖淀粉酶(GA-Themi)蛋白的表达与纯化 | 第27-30页 |
| 2.3.1 聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)及所用试剂的配制 | 第27页 |
| 2.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第27-28页 |
| 2.3.3 镍柱纯化所用试剂的配制 | 第28页 |
| 2.3.4 Brodford法测定蛋白浓度 | 第28-29页 |
| 2.3.5 镍柱亲和层析纯化蛋白 | 第29-30页 |
| 2.4 酶学特性与水解产物的检测 | 第30-33页 |
| 2.4.1 DNS法测酶活 | 第30-31页 |
| 2.4.2 DNS的配制 | 第31页 |
| 2.4.3 酶学性质的测定 | 第31-32页 |
| 2.4.4 薄层层析(TLC)的原理 | 第32-33页 |
| 2.4.5 薄层层析(TLC)的方法 | 第33页 |
| 3 实验结果 | 第33-47页 |
| 3.1 基因序列的获取与分析 | 第33页 |
| 3.1.1 信号肽分析 | 第33页 |
| 3.1.2 获得GA-Themi的基因 | 第33页 |
| 3.2 GA-Themi蛋白的克隆表达 | 第33-35页 |
| 3.2.1 目的基因(ga-themi)与pET28a载体质粒的获得 | 第33-34页 |
| 3.2.2 重组子的筛选与鉴定 | 第34-35页 |
| 3.3 蛋白的表达与纯化 | 第35-36页 |
| 3.4 GA-Themi蛋白的酶学特性 | 第36-38页 |
| 3.4.1 比酶活的测定 | 第36页 |
| 3.4.2 最适pH | 第36页 |
| 3.4.3 最适温度 | 第36-37页 |
| 3.4.4 热稳定性 | 第37-38页 |
| 3.4.5 金属离子耐受性 | 第38页 |
| 3.5 GA-Themi蛋白的底物特异性 | 第38-39页 |
| 3.6 GA-Themi蛋白的水解产物分析 | 第39-43页 |
| 3.6.1 淀粉水解产物 | 第39-40页 |
| 3.6.2 普鲁兰糖水解产物 | 第40-42页 |
| 3.6.3 麦芽糖水解产物 | 第42-43页 |
| 3.6.4 麦芽三糖水解产物 | 第43页 |
| 3.7 葡萄糖淀粉酶GA-Themi在CAZy中的分布 | 第43-47页 |
| 3.7.1 葡萄糖淀粉酶(GA-Themi) BLAST相似性分析 | 第43-44页 |
| 3.7.2 GA-Themi分别与GH 57、GH15、GH97家族蛋白保守序列分析 | 第44-46页 |
| 3.7.3 GA-Themi蛋白与GH57家族进化树的分析 | 第46-47页 |
| 4 讨论 | 第47-50页 |
| 第三章 从GH13家族中筛选来源于Acidilobus sp.7A的α-淀粉酶蛋白序列并克隆表达 | 第50-58页 |
| 1 实验材料 | 第50页 |
| 1.1 蛋白序列来源 | 第50页 |
| 1.2 菌株与质粒 | 第50页 |
| 1.3 生物信息学分析 | 第50页 |
| 1.4 实验仪器 | 第50页 |
| 1.5 实验试剂 | 第50页 |
| 1.6 培养基及实验试剂 | 第50页 |
| 2 实验方法 | 第50-51页 |
| 2.1 生物信息学分析 | 第50-51页 |
| 2.1.1 蛋白序列的筛选 | 第50页 |
| 2.1.2 AmyAC与GH13家族蛋白序列保守位点的分析 | 第50页 |
| 2.1.3 AmyAC与GH13家族蛋白序列系统进化树的构建 | 第50页 |
| 2.1.4 AmyAC蛋白的信号肽分析 | 第50-51页 |
| 2.1.5 amyac基因的获取 | 第51页 |
| 2.2 构建AmyAC的重组表达菌株 | 第51页 |
| 2.3 蛋白的表达与纯化 | 第51页 |
| 3 实验结果 | 第51-55页 |
| 3.1 生物信息学分析 | 第51-53页 |
| 3.1.1 AmyAC与GH13家族蛋白序列保守位点的分析 | 第51页 |
| 3.1.2 AmyAC与GH13家族蛋白序列系统进化树的构建 | 第51-52页 |
| 3.1.3 AmyAC蛋白的信号肽分析 | 第52-53页 |
| 3.1.4 amyac基因的合成 | 第53页 |
| 3.2 AmyAC蛋白的克隆 | 第53-55页 |
| 3.2.1 amyac基因片段与p-ClodⅢ质粒的获取 | 第53-54页 |
| 3.2.2 amyac基因和p-ColdⅢ重组的质粒双酶切验证 | 第54-55页 |
| 3.3 蛋白的表达与纯化 | 第55页 |
| 3.3.1 蛋白纯化实验结果 | 第55页 |
| 3.4 酶活的测定 | 第55页 |
| 4 讨论 | 第55-58页 |
| 参考文献 | 第58-64页 |
| 附录 | 第64-72页 |
| 致谢 | 第72-73页 |
| 研究生期间发表论文 | 第73页 |
