| 摘要 | 第10-11页 |
| 英文摘要 | 第11-12页 |
| 1 引言 | 第13-27页 |
| 1.1 研究的目的和意义 | 第13-14页 |
| 1.1.1 鸡的脂肪细胞分化研究 | 第13-14页 |
| 1.1.2 脂肪细胞分化研究的细胞模型 | 第14页 |
| 1.1.3 研究的目的与意义 | 第14页 |
| 1.2 鸡的细胞永生化研究进展 | 第14-18页 |
| 1.2.1 细胞衰老与永生化 | 第14-15页 |
| 1.2.2 细胞永生化的方法 | 第15页 |
| 1.2.3 鸡细胞永生化的方法 | 第15-16页 |
| 1.2.4 端粒酶与细胞永生化 | 第16页 |
| 1.2.5 端粒酶与鸡细胞永生化 | 第16-18页 |
| 1.3 鸡的端粒生物学研究进展 | 第18-24页 |
| 1.3.1 鸡的端粒 | 第18-20页 |
| 1.3.2 鸡的端粒酶 | 第20-24页 |
| 1.4 研究的主要内容及技术路线 | 第24-27页 |
| 1.4.1 本研究的主要内容 | 第24-25页 |
| 1.4.2 本研究的技术路线 | 第25-27页 |
| 2 材料与方法 | 第27-50页 |
| 2.1 实验材料 | 第27-30页 |
| 2.1.1 实验动物 | 第27页 |
| 2.1.2 菌株、细胞系和载体 | 第27页 |
| 2.1.3 主要药品及其配制 | 第27-29页 |
| 2.1.4 主要仪器设备 | 第29页 |
| 2.1.5 试剂和试剂盒 | 第29页 |
| 2.1.6 主要生物学软件 | 第29-30页 |
| 2.2 实验方法 | 第30-50页 |
| 2.2.1 RNA提取和cDNA合成 | 第30-31页 |
| 2.2.2 chTERT和chTR的克隆 | 第31-34页 |
| 2.2.3 逆转录病毒表达载体的构建 | 第34-35页 |
| 2.2.4 细胞系的培养与转染 | 第35-36页 |
| 2.2.5 逆转录病毒的制备与滴度测定 | 第36-37页 |
| 2.2.6 鸡前脂肪细胞的分离和培养 | 第37-38页 |
| 2.2.7 抗生素最佳筛选浓度的确定 | 第38页 |
| 2.2.8 永生化鸡前脂肪细胞的筛选 | 第38-39页 |
| 2.2.9 β-gal染色分析 | 第39页 |
| 2.2.10 半定量和实时定量RT-PCR基因表达分析 | 第39-41页 |
| 2.2.11 端粒重复扩增分析(TRAP) | 第41-42页 |
| 2.2.12 DNA倍体分析 | 第42-43页 |
| 2.2.13 锚定不依赖性生长分析 | 第43页 |
| 2.2.14 同工酶分析 | 第43-44页 |
| 2.2.15 PCR物种鉴定 | 第44-45页 |
| 2.2.16 鸡前脂肪细胞的诱导分化 | 第45-46页 |
| 2.2.17 油红O染色和定量 | 第46页 |
| 2.2.18 永生化鸡前脂肪细胞系的基因表达谱分析 | 第46-49页 |
| 2.2.19 数据的统计分析 | 第49-50页 |
| 3 结果与分析 | 第50-98页 |
| 3.1 chTERT和chTR的克隆 | 第50-52页 |
| 3.1.1 chTERT的克隆 | 第50-51页 |
| 3.1.2 chTR的克隆 | 第51-52页 |
| 3.2 逆转录病毒表达载体的构建 | 第52-53页 |
| 3.3 鸡永生化前脂肪细胞系的筛选和建立 | 第53-55页 |
| 3.3.1 逆转录病毒的包装及滴度测定 | 第53页 |
| 3.3.2 最佳药物筛选浓度和最佳细胞铺板密度的测定 | 第53-54页 |
| 3.3.3 逆转录病毒转导chTERT和chTR建立永生化的鸡前脂肪细胞系 | 第54-55页 |
| 3.4 永生化鸡前脂肪细胞系的形态学比较及衰老分析 | 第55-59页 |
| 3.4.1 永生化鸡前脂肪细胞系与原代鸡前脂肪细胞的形态学比较 | 第55-56页 |
| 3.4.2 细胞衰老的检测分析 | 第56-59页 |
| 3.5 细胞的端粒酶活性分析 | 第59-61页 |
| 3.5.1 RT-PCR检测chTERT和chTR的表达 | 第59页 |
| 3.5.2 TRAP法检测细胞的端粒酶活性 | 第59-61页 |
| 3.6 细胞的恶性转化分析 | 第61-63页 |
| 3.6.1 DNA倍体分析 | 第61-62页 |
| 3.6.2 锚定不依赖性分析 | 第62-63页 |
| 3.7 细胞的种属鉴定 | 第63-68页 |
| 3.7.1 同工酶分析 | 第63-64页 |
| 3.7.2 基于PCR的物种鉴定分析 | 第64-68页 |
| 3.8 细胞的分化特性分析 | 第68-73页 |
| 3.8.1 ICP1和ICP2前脂肪细胞的体外诱导分化 | 第68-70页 |
| 3.8.2 鸡脂肪细胞分化相关标记基因的表达分析 | 第70-73页 |
| 3.9 ICP1和ICP2细胞系的基因表达谱分析 | 第73-98页 |
| 3.9.1 基因芯片样品的制备 | 第74-75页 |
| 3.9.2 芯片杂交 | 第75-76页 |
| 3.9.3 芯片数据的预处理 | 第76-77页 |
| 3.9.4 ICP1和ICP2细胞基因表达谱的比较 | 第77-86页 |
| 3.9.5 ICP2前脂肪细胞分化过程中的基因表达谱分析 | 第86-98页 |
| 4 讨论 | 第98-104页 |
| 4.1 鸡前脂肪细胞端粒酶活性限速成分的确定 | 第98页 |
| 4.2 chTR对鸡前脂肪细胞永生化的作用 | 第98-99页 |
| 4.3 病毒癌基因对前脂肪细胞分化的影响 | 第99页 |
| 4.4 鸡端粒的维持机制与永生化 | 第99-100页 |
| 4.5 染色体变异与细胞永生化 | 第100页 |
| 4.6 鸡永生化前脂肪细胞的物种鉴定 | 第100-101页 |
| 4.7 鸡永生化前脂肪细胞系的分化特性分析 | 第101页 |
| 4.8 ICP1和ICP2细胞的基因表达谱比较分析 | 第101-102页 |
| 4.9 ICP2前脂肪细胞分化过程中的基因表达谱分析 | 第102-103页 |
| 4.10 建立鸡永生化前脂肪细胞的意义 | 第103-104页 |
| 5 结论 | 第104-105页 |
| 致谢 | 第105-106页 |
| 参考文献 | 第106-118页 |
| 附录 | 第118-127页 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 | 第127页 |
