| 摘要 | 第1-8页 |
| ABSTRACT | 第8-16页 |
| 文献综述 | 第16-44页 |
| 第一章 多能性干细胞研究进展 | 第16-29页 |
| ·产生多能性干细胞的基本策略 | 第17页 |
| ·核移植获得多能性干细胞 | 第17-19页 |
| ·体细胞与ES细胞融合重编程为ES细胞 | 第19-20页 |
| ·细胞培养自发性重编程为多能性干细胞 | 第20-22页 |
| ·转染多能性转录因子诱导体细胞为多能性干细胞 | 第22-23页 |
| ·多能性相关转录因子在维持细胞多能性中的作用 | 第23页 |
| ·Oct-3/4的功能 | 第23页 |
| ·Sox2的功能 | 第23-24页 |
| ·Nanog的功能 | 第24-25页 |
| ·c-Myc的功能 | 第25页 |
| ·Klf4的功能 | 第25-26页 |
| ·Lin28的功能 | 第26-27页 |
| ·多能性相关转录因子诱导细胞多能性的分子机理 | 第27-29页 |
| 第二章 转染特定转录因子产生iPS细胞研究进展 | 第29-44页 |
| 引言 | 第29-30页 |
| ·转录因子与小分子化合物的选择应用 | 第30页 |
| ·转录因子的选择与应用 | 第30-31页 |
| ·小分子化合物的选择与应用 | 第31-32页 |
| ·重编程中转录因子导入方法 | 第32页 |
| ·逆转录病毒转染系统 | 第32页 |
| ·慢病毒转染系统 | 第32-33页 |
| ·腺病毒转染系统 | 第33页 |
| ·质粒瞬时转染系统 | 第33-34页 |
| ·靶细胞的种类与选用 | 第34页 |
| ·影响转录因子表达的主要因素 | 第34-36页 |
| ·iPS细胞培养条件的建立及其应用 | 第36-37页 |
| ·iPS细胞克隆鉴别方法 | 第37-38页 |
| ·iPS细胞传代培养方法及其生物学特性的鉴定方法 | 第38-39页 |
| ·形态学鉴定 | 第39页 |
| ·分子水平鉴定 | 第39-40页 |
| ·iPS细胞功能方面的鉴定标准 | 第40-41页 |
| ·iPS细胞生物学特性最低鉴定标准 | 第41-42页 |
| ·iPS细胞重编程效率的评估方法 | 第42-44页 |
| 试验研究 | 第44-119页 |
| 第三章 牛Nanog与Lin28基因ORF全序列克隆及变异分析 | 第44-55页 |
| 引言 | 第44页 |
| ·材料 | 第44-45页 |
| ·主要材料与试剂 | 第44-45页 |
| ·主要仪器设备 | 第45页 |
| ·方法 | 第45-49页 |
| ·引物设计与合成 | 第45页 |
| ·奶牛胎儿原始生殖嵴获得与总RNA提取 | 第45页 |
| ·RT反应 | 第45-46页 |
| ·PCR反应 | 第46页 |
| ·PCR产物回收与pMD18-T载体的连接 | 第46-47页 |
| ·感受态细胞制备与转化 | 第47页 |
| ·重组质粒鉴定 | 第47-49页 |
| ·结果 | 第49-52页 |
| ·奶牛Nanog基因与Lin28基因RT-PCR扩增结果 | 第49-50页 |
| ·含有重组质粒菌落初步鉴定结果 | 第50页 |
| ·重组质粒酶切鉴定结果 | 第50-51页 |
| ·重组质粒PCR鉴定结果 | 第51页 |
| ·Nanog基因与Lin28基因核苷酸序列测定与变异分析 | 第51-52页 |
| ·讨论 | 第52-54页 |
| ·Nanog在维持多能性中的作用 | 第52页 |
| ·Lin28在维持多能性中的作用 | 第52-53页 |
| ·转录因子在体细胞重编程中应用 | 第53-54页 |
| ·小结 | 第54-55页 |
| 第四章 牛Nanog与Lin28基因逆转录病毒载体的构建与包装 | 第55-72页 |
| 引言 | 第55页 |
| ·材料 | 第55-56页 |
| ·基因、质粒载体与细胞株 | 第55-56页 |
| ·主要试剂 | 第56页 |
| ·主要仪器设备 | 第56页 |
| ·方法 | 第56-61页 |
| ·质粒TN与TL的酶切与回收 | 第56-57页 |
| ·基因片段与逆转录病毒载体的连接 | 第57页 |
| ·重组逆转录病毒质粒的转化与克隆扩增 | 第57页 |
| ·重组逆转录病毒质粒的鉴定 | 第57-59页 |
| ·G418对PT67细胞与NIH3T3细胞最小致死量的测定 | 第59页 |
| ·重组逆转录病毒质粒的包装与转染效率的测定 | 第59-60页 |
| ·重组逆转录病毒感染滴度的测定 | 第60页 |
| ·重组逆转录病毒颗粒形态电镜观察 | 第60页 |
| ·包装细胞中重组逆转录病毒的表达与鉴定 | 第60页 |
| ·重组逆转录病毒液中野生型病毒的检测 | 第60-61页 |
| ·结果 | 第61-69页 |
| ·重组逆转录病毒质粒MN与ML构建与鉴定 | 第61-63页 |
| ·G418对PT67细胞与NIH3T3细胞最小致死量的测定结果 | 第63-64页 |
| ·产毒细胞株筛选与病毒滴度测定 | 第64-65页 |
| ·重组逆转录病毒质粒在PT67包装细胞中转染效率测定结果 | 第65-66页 |
| ·重组逆转录病毒颗粒的形态 | 第66-67页 |
| ·逆转录病毒质粒MN与ML在包装细胞中的表达与鉴定 | 第67-68页 |
| ·重组逆转录病毒液中野生型病毒的检测 | 第68-69页 |
| ·讨论 | 第69-71页 |
| ·小结 | 第71-72页 |
| 第五章 牛诱导性多能干细胞系的建立 | 第72-97页 |
| 引言 | 第72页 |
| ·材料 | 第72-75页 |
| ·主要试剂 | 第72-73页 |
| ·主要溶液的配制 | 第73-74页 |
| ·主要仪器设备 | 第74-75页 |
| ·方法 | 第75-80页 |
| ·原代牛皮肤成纤维细胞的分离培养 | 第75页 |
| ·BDFs的生物学特性鉴定 | 第75-76页 |
| ·脱细胞人羊膜支架的制备 | 第76-77页 |
| ·逆转录病毒转染BDFs | 第77-78页 |
| ·牛诱导性多能干细胞的产生 | 第78-79页 |
| ·牛iPSCs细胞生物学特性的鉴定 | 第79-80页 |
| ·结果 | 第80-91页 |
| ·原代牛皮肤成纤维细胞的获得、纯化与传代培养 | 第80-82页 |
| ·牛皮肤成纤维细胞形态及免疫细胞化学染色 | 第82页 |
| ·牛皮肤成纤维细胞生长曲线与群体倍增时间 | 第82-83页 |
| ·牛皮肤成纤维细胞细胞周期测定结果 | 第83-84页 |
| ·脱细胞人羊膜支架结构 | 第84-85页 |
| ·牛诱导性多能够干细胞的获得与传代培养 | 第85-87页 |
| ·牛iPS细胞集落形成时间与重编程效率 | 第87页 |
| ·不同冻存液对牛iPS细胞冻存效果的影响 | 第87页 |
| ·牛iPS细胞集落形态与AKP染色结果 | 第87-88页 |
| ·牛iPS细胞生物学特性 | 第88-90页 |
| ·牛iPS细胞核型表现 | 第90-91页 |
| ·讨论 | 第91-96页 |
| ·牛皮肤成纤维细胞的分离与纯化 | 第91-92页 |
| ·体细胞重编程与牛iPS细胞的产生 | 第92-94页 |
| ·牛iPS细胞培养体系的建立 | 第94-95页 |
| ·牛iPS细胞的重编程效率 | 第95页 |
| ·牛iPS细胞生物学特征 | 第95-96页 |
| ·小结 | 第96-97页 |
| 第六章 牛iPS细胞分化潜能的鉴定 | 第97-119页 |
| 引言 | 第97-98页 |
| ·材料 | 第98页 |
| ·牛iPS细胞株 | 第98页 |
| ·试剂与试验动物 | 第98页 |
| ·主要仪器 | 第98页 |
| ·方法 | 第98-105页 |
| ·牛iPS细胞基因表达谱检测 | 第98-99页 |
| ·牛iPS细胞多能性基因表达水平分析 | 第99-101页 |
| ·牛iPS细胞多能性蛋白质表达分析 | 第101-102页 |
| ·牛iPS细胞表观遗传特征分析 | 第102-103页 |
| ·牛iPS细胞形成类胚体与体外分化能力测定 | 第103-104页 |
| ·牛iPS细胞形成畸胎瘤与体内分化能力测定 | 第104-105页 |
| ·牛iPS细胞生产牛羊嵌合体动物及其鉴定 | 第105页 |
| ·结果 | 第105-114页 |
| ·牛iPS细胞基因表达谱分析 | 第105-106页 |
| ·牛iPS细胞多能性相关蛋白表达 | 第106页 |
| ·牛iPS细胞多能性基因表达水平 | 第106-107页 |
| ·牛iPS细胞Nanog与Oct4基因启动子序列甲基化特征 | 第107-108页 |
| ·形成类胚体与体外自由分化能力 | 第108-109页 |
| ·类胚体介导牛iPS细胞定向分化为神经细胞 | 第109-111页 |
| ·形成畸胎瘤与体内分化能力 | 第111-113页 |
| ·牛羊嵌合体动物的产生及其鉴定 | 第113-114页 |
| ·讨论 | 第114-117页 |
| ·iPS细胞基因及蛋白质表达特征 | 第114-115页 |
| ·牛iPS细胞中Nanog与Oct4基因启动子序列甲基化模式 | 第115-116页 |
| ·牛iPS细胞体外分化能力 | 第116页 |
| ·牛iPS细胞体内分化能力 | 第116-117页 |
| ·小结 | 第117-119页 |
| 结论 | 第119-120页 |
| 创新之处和进一步研究的课题 | 第120-121页 |
| 参考文献 | 第121-135页 |
| 附录 | 第135-139页 |
| 缩略词 | 第139-141页 |
| 致谢 | 第141-143页 |
| 作者简介 | 第143-144页 |
