| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 英文缩略词表 | 第12-13页 |
| 第1章 绪论 | 第13-33页 |
| 1.1 蛇毒丝氨酸蛋白酶概述 | 第13-14页 |
| 1.2 蛇毒类凝血酶研究概述 | 第14-16页 |
| 1.2.1 蛇毒类凝血酶的分布 | 第14-15页 |
| 1.2.2 蛇毒类凝血酶的理化特性研究 | 第15页 |
| 1.2.3 蛇毒类凝血酶药理学作用 | 第15-16页 |
| 1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第16-28页 |
| 1.3.1 巴斯德毕赤酵母甲醇代谢途径 | 第17-18页 |
| 1.3.2 毕赤酵母系统菌株及表达载体 | 第18-22页 |
| 1.3.3 影响外源蛋白在毕赤酵母中高效表达的影响因素 | 第22-28页 |
| 1.4 蛇毒类凝血酶基因工程表达研究与应用前景 | 第28-30页 |
| 1.4.1 蛇毒类凝血酶基因工程表达研究 | 第28-29页 |
| 1.4.2 蛇毒类凝血酶应用前景 | 第29-30页 |
| 1.5 本论文的选题依据和研究内容 | 第30-33页 |
| 第2章 GI-TLE1序列生物信息学分析及密码子优化 | 第33-37页 |
| 2.1 实验方法 | 第33-34页 |
| 2.1.1 GI-TLE1基因的生物信息学分析 | 第33页 |
| 2.1.2 GI-TLE1基因密码子优化 | 第33-34页 |
| 2.2 实验结果 | 第34-37页 |
| 2.2.1 GI-TLE1基因及氨基酸序列分析 | 第34-35页 |
| 2.2.2 GI-TLE1基因对应的氨基酸序列同源性比对 | 第35-36页 |
| 2.2.3 GI-TLE1基因密码子优化 | 第36-37页 |
| 第3章 pPIC9K/GI-TLE1重组载体的构建 | 第37-47页 |
| 3.1 实验材料 | 第37-38页 |
| 3.1.1 实验菌种及载体 | 第37页 |
| 3.1.2 仪器设备 | 第37-38页 |
| 3.1.3 实验主要试剂 | 第38页 |
| 3.1.4 实验溶液 | 第38页 |
| 3.2 实验过程 | 第38-43页 |
| 3.2.1 合成GI-TLE1基因及引物 | 第38页 |
| 3.2.2 GI-TLE1基因的获得 | 第38-40页 |
| 3.2.3 pPIC9K载体获得 | 第40-41页 |
| 3.2.4 PCR产物及表达载体双酶切及回收 | 第41页 |
| 3.2.5 目的基因与载体连接 | 第41-42页 |
| 3.2.6 TOP10感受态细胞的制备 | 第42页 |
| 3.2.7 转化 | 第42页 |
| 3.2.8 重组GI-TLE1质粒的提取及PCR验证 | 第42-43页 |
| 3.3 实验结果 | 第43-47页 |
| 3.3.1 GI-TLE1基因PCR扩增 | 第43页 |
| 3.3.2 pPIC9K载体双酶切 | 第43-44页 |
| 3.3.3 PCR鉴定阳性克隆 | 第44-47页 |
| 第4章 重组载体电转化入毕赤酵母及转化子的筛选与鉴定 | 第47-55页 |
| 4.1 实验材料 | 第47页 |
| 4.1.1 实验试剂 | 第47页 |
| 4.1.2 实验仪器 | 第47页 |
| 4.2 实验方法 | 第47-50页 |
| 4.2.1 重组载体的线性化及回收 | 第47-48页 |
| 4.2.2 制备GS115酵母感受态细胞 | 第48页 |
| 4.2.3 重组质粒电转化毕赤酵母GS115 | 第48页 |
| 4.2.4 阳性克隆的高抗性转化子筛选及整型鉴定 | 第48-49页 |
| 4.2.5 酵母基因组的提取及PCR验证 | 第49-50页 |
| 4.3 实验结果 | 第50-55页 |
| 4.3.1 重组载体pPIC9K/GI-TLE1线性化 | 第50-51页 |
| 4.3.2 重组载体pPIC9K/GI-TLE1电转化入GS115 | 第51页 |
| 4.3.3 高抗性克隆筛选 | 第51-52页 |
| 4.3.4 高抗性转换子整型鉴定 | 第52-53页 |
| 4.3.5 高抗性转化子基因组DNA的PCR鉴定 | 第53-55页 |
| 第5章 重组GI-TLE1蛋白的诱导表达及发酵条件优化 | 第55-65页 |
| 5.1 实验材料 | 第55页 |
| 5.1.1 实验仪器 | 第55页 |
| 5.1.2 实验试剂 | 第55页 |
| 5.1.3 实验溶液 | 第55页 |
| 5.2 实验方法 | 第55-59页 |
| 5.2.1 重组GI-TLE1蛋白的初步诱导表达 | 第55-56页 |
| 5.2.2 重组GI-TLE1蛋白的初步鉴定 | 第56-59页 |
| 5.3 实验结果 | 第59-65页 |
| 5.3.1 Bradford法测定蛋白浓度 | 第59-60页 |
| 5.3.2 不同发酵时间rGI-TLE1的SDS-PAGE分析 | 第60页 |
| 5.3.3 不同时间诱导下上清蛋白活性测定 | 第60-61页 |
| 5.3.4 不同甲醇浓度诱导下上清蛋白活性测定 | 第61-62页 |
| 5.3.5 不同pH诱导下上清蛋白活性测定 | 第62页 |
| 5.3.6 不同温度诱导下上清蛋白活性测定 | 第62-63页 |
| 5.3.7 添加不同抗氧化剂后上清样品活性测定 | 第63-65页 |
| 第6章 重组GI-TLE1蛋白纯化及生物活性鉴定 | 第65-71页 |
| 6.1 实验材料 | 第65页 |
| 6.1.1 实验仪器 | 第65页 |
| 6.1.2 实验试剂 | 第65页 |
| 6.2 实验方法 | 第65-67页 |
| 6.2.1 重组蛋白纯化 | 第65-66页 |
| 6.2.2 重组GI-TLE1蛋白生物活性鉴定 | 第66-67页 |
| 6.3 实验结果 | 第67-71页 |
| 6.3.1 NI-NTA纯化后SDS-PAGE检测 | 第67-68页 |
| 6.3.2 抑制剂对重组GI-TLE1蛋白的影响 | 第68-69页 |
| 6.3.3 类凝血酶活性检测 | 第69页 |
| 6.3.4 纤溶活性平板检测 | 第69-71页 |
| 第7章 讨论 | 第71-77页 |
| 7.1 重组GI-TLE1酵母表达载体的选择与构建 | 第71页 |
| 7.2 重组载体线性化选择 | 第71-72页 |
| 7.3 转化入毕赤酵母基因组方法选择 | 第72页 |
| 7.4 阳性转化子鉴定方法的选择 | 第72-73页 |
| 7.5 诱导表达条件优化情况 | 第73-74页 |
| 7.6 类凝血酶相关活性情况的探讨 | 第74-77页 |
| 参考文献 | 第77-85页 |
| 附录 | 第85-91页 |
| 致谢 | 第91-93页 |
| 攻读硕士期间研究成果 | 第93页 |
