| 目录 | 第1-9页 |
| 中文摘要 | 第9-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-39页 |
| 1 猪繁殖与呼吸综合征研究进展 | 第12-38页 |
| ·PRRSV概述 | 第12-13页 |
| ·猪繁殖与呼吸综合征病毒的病原学特性 | 第13-15页 |
| ·PRRSV的分类 | 第13-14页 |
| ·PRRSV的理化学特性 | 第14页 |
| ·PRRSV病毒培养特性 | 第14-15页 |
| ·PRRSV分子生物学研究进展 | 第15-25页 |
| ·PRRS病毒基因组的结构与特点 | 第15-16页 |
| ·PRRSV基因组的套式转录方式 | 第16-17页 |
| ·PRRSV基因组编码的非结构蛋白与功能 | 第17-18页 |
| ·PRRSV基因组编码的结构蛋白与功能 | 第18-25页 |
| ·ORF2编码的结构蛋白GP2a、GP2b | 第18-20页 |
| ·ORF3编码的结构蛋白GP3 | 第20页 |
| ·ORF4编码的结构蛋白GP4 | 第20-21页 |
| ·ORF5编码的结构蛋白GP5(E蛋白) | 第21-23页 |
| ·ORF6编码的结构蛋白GP6(M蛋白) | 第23-24页 |
| ·ORF7编码的结构蛋白GP7(N蛋白) | 第24-25页 |
| ·PRRSV免疫学研究进展 | 第25-31页 |
| ·抗PRRSV的体液免疫反应 | 第26-27页 |
| ·抗PRRSV的细胞免疫反应 | 第27-29页 |
| ·PRRSV免疫调节和免疫逃逸研究进展 | 第29-31页 |
| ·PRRSV抑制IFN-a的产生 | 第29页 |
| ·PRRSV诱导细胞因子IL10的产生 | 第29-30页 |
| ·PRRSV阻碍的正确抗原递呈和活化作用 | 第30页 |
| ·免疫逃逸与体液免疫 | 第30页 |
| ·天然免疫 | 第30-31页 |
| ·PRRS疫苗防控研究进展 | 第31-38页 |
| ·灭活疫苗 | 第32-33页 |
| ·弱毒疫苗 | 第33-34页 |
| ·亚单位疫苗 | 第34-35页 |
| ·活载体疫苗 | 第35-36页 |
| ·核酸疫苗 | 第36-38页 |
| 2 研究的目的与意义 | 第38-39页 |
| 第二章 PRRSV ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、ORF7基因PCI真核表达质粒的构建及在VERO细胞中的表达研究 | 第39-62页 |
| 1 材料与方法 | 第39-53页 |
| ·实验材料 | 第39-40页 |
| ·病毒来源 | 第39页 |
| ·细胞、菌株及载体 | 第39-40页 |
| ·主要试剂 | 第40页 |
| ·主要仪器 | 第40页 |
| ·实验方法 | 第40-53页 |
| ·六个目的基因片段的RT-PCR扩增 | 第40-43页 |
| ·特异性引物设计与合成 | 第40-41页 |
| ·PRRSV SCS变异株的增殖 | 第41页 |
| ·PRRSV SCS株基因组RNA的提取 | 第41-42页 |
| ·病毒RNA的反转录扩增 | 第42页 |
| ·病毒六个目的基因片段的体外扩增 | 第42-43页 |
| ·六个目的基因片段的TA克隆 | 第43-46页 |
| ·六个RT-PCR产物目的基因片段回收纯化 | 第43页 |
| ·六个目的基因片段与克隆载体pMD19-Tsimple连接 | 第43页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第43-44页 |
| ·六个TA连接产物转化大肠杆菌 | 第44页 |
| ·重组质粒DNA的小量制备 | 第44-45页 |
| ·六个目的基因TA克隆的酶切鉴定 | 第45页 |
| ·目的基因TA克隆的PCR鉴定 | 第45-46页 |
| ·目的基因TA克隆的序列测定 | 第46页 |
| ·pCI真核表达载体的构建 | 第46-48页 |
| ·真核表达载体质粒pCI-neo的准备 | 第46页 |
| ·目的片段的准备 | 第46-47页 |
| ·构建pCI真核表达载体pCI-ORF2、pCI-ORF3、pCI-ORF4、pCI-ORF5、pCI-ORF6、pCI-ORF7 | 第47页 |
| ·pCI重组表达载体转化DH5a | 第47页 |
| ·pCI重组表达载体的酶切鉴定 | 第47-48页 |
| ·pCI重组表达载体的PCR鉴定 | 第48页 |
| ·pCI真核表达载体在Vero细胞中瞬时表达研究 | 第48-51页 |
| ·pCI真核表达载体DNA的小量抽提与纯化 | 第48-49页 |
| ·转染用Vero细胞的准备 | 第49-50页 |
| ·pCI真核表达载体转染Vero细胞 | 第50-51页 |
| ·pCI重组载体转录的RT-PCR检测 | 第51页 |
| ·pCI重组载体表达的间接免疫荧光试验 | 第51页 |
| ·Western blot检测pCI重组载体在细胞中表达 | 第51-53页 |
| ·样品准备 | 第51-52页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第52页 |
| ·Western blot检测分析 | 第52-53页 |
| 2 结果 | 第53-59页 |
| ·PRRSV SCS株六个目的基因片段的RT-PCR扩增 | 第53-54页 |
| ·六个目的基因片段的TA克隆 | 第54-55页 |
| ·目的基因TA克隆的酶切鉴定及PCR鉴定 | 第54-55页 |
| ·目的基因的核苷酸序列测定 | 第55页 |
| ·含目的基因的pCI真核表达载体的构建与鉴定 | 第55-56页 |
| ·pCI真核表达载体在Vero细胞中的表达 | 第56-59页 |
| ·pCI重组载体转录的RT-PCR检测 | 第56-57页 |
| ·pCI重组载体表达的间接免疫荧光检测 | 第57-58页 |
| ·Western blot检测pCI重组载体在细胞中表达 | 第58-59页 |
| 3 讨论 | 第59-61页 |
| ·关于PRRSV主要结构蛋白 | 第59-60页 |
| ·关于真核表达 | 第60-61页 |
| 4 小结 | 第61-62页 |
| 第三章 真核重组质粒PCI-ORF2、PCI-ORF3、PCI-ORF4、PCI-ORF5、PCI-ORF6、PCI-ORF7在小鼠体内诱导的免疫反应 | 第62-80页 |
| 1 材料和方法 | 第63-68页 |
| ·实验材料 | 第63页 |
| ·载体、菌株及实验动物 | 第63页 |
| ·主要试剂 | 第63页 |
| ·主要仪器抗体 | 第63页 |
| ·实验方法 | 第63-68页 |
| ·DNA重组质粒的制备 | 第63-65页 |
| ·实验小鼠分组与免疫 | 第65页 |
| ·小鼠淋巴因子IL-4、IL-2、IFN-Y的检测 | 第65-66页 |
| ·小鼠淋巴因子IL-4的检测 | 第65-66页 |
| ·小鼠淋巴因子IL-2的检测 | 第66页 |
| ·小鼠淋巴因子IFN-γ的检测 | 第66页 |
| ·荧光定量对BCL10、INF-β、TLR3与TLR4表达的检测 | 第66-68页 |
| ·样品总RNA的制备 | 第66-67页 |
| ·样品总RNA的反转录反应 | 第67页 |
| ·目的基因cDNA的荧光定量PCR反应 | 第67页 |
| ·荧光定量RT-PCR扩增曲线、融解曲线以及扩增效率曲线的制作 | 第67-68页 |
| ·数据统计 | 第68页 |
| 2 结果 | 第68-77页 |
| ·小鼠淋巴因子IL-4、IL-2、IFN-γ的检测结果 | 第68-70页 |
| ·小鼠淋巴因子IL-4的检测结果 | 第68-69页 |
| ·小鼠淋巴因子IL-2的检测结果 | 第69页 |
| ·小鼠淋巴因子IFN-γ的检测结果 | 第69-70页 |
| ·荧光定量对BCL10、INF-β、TLR3与TLR4表达的检测结果 | 第70-77页 |
| ·目的基因及内参基因的荧光定量RT-PCR产物测序结果 | 第70页 |
| ·目的基因BCL10、INF-β、TLR3、TLR4表达分析 | 第70-77页 |
| ·TLR3基因的转录水平 | 第70-72页 |
| ·TLR4基因的转录水平 | 第72-73页 |
| ·INF-β基因的转录水平 | 第73-75页 |
| ·BCL10基因的转录水平 | 第75-77页 |
| 3 讨论 | 第77-79页 |
| ·关于PRRSV各结构蛋白的免疫作用 | 第77-78页 |
| ·关于淋巴因子的免疫保护 | 第78-79页 |
| ·关于BCL10、INF-β、TLR3、TLR4的免疫保护 | 第79页 |
| 4 小结 | 第79-80页 |
| 第四章 真核重组质粒PCI-ORF3、PCI-ORF4、PCI-ORF5、PCI-ORF6在猪体内诱导的免疫反应 | 第80-93页 |
| 1 材料和方法 | 第81-84页 |
| ·实验材料 | 第81页 |
| ·载体、菌株及实验动物 | 第81页 |
| ·主要试剂 | 第81页 |
| ·主要仪器抗体 | 第81页 |
| ·实验方法 | 第81-84页 |
| ·DNA重组质粒的制备 | 第81-82页 |
| ·实验猪分组与免疫 | 第82页 |
| ·猪外周血T淋巴细胞亚群的动态检测 | 第82页 |
| ·猪淋巴因子IL-4、IL-2、IFN-γ的检测 | 第82-84页 |
| ·猪淋巴因子IL-4的检测 | 第82-84页 |
| ·猪淋巴因子IL-2的检测 | 第84页 |
| ·猪淋巴因子IFN-γ的检测 | 第84页 |
| 2 结果 | 第84-89页 |
| ·基因疫苗免疫猪后对猪临床症状影响 | 第84页 |
| ·基因疫苗免疫仔猪后T淋巴细胞亚群数量变化 | 第84-87页 |
| ·基因免疫仔猪后CD3~+ T淋巴细胞数量变化 | 第84-85页 |
| ·基因疫苗免疫后仔猪外周血CD4~+ T淋巴细胞变化 | 第85-86页 |
| ·基因疫苗免疫后仔猪CD8~+ T淋巴细胞数量变化 | 第86-87页 |
| ·基因疫苗免疫仔猪后外周血IL-2、IL-4及INF-γ水平变化 | 第87-89页 |
| ·基因疫苗免疫仔猪后IL-2水平变化 | 第87-88页 |
| ·基因疫苗免疫仔猪后IL-4水平变化 | 第88-89页 |
| ·基因疫苗免疫仔猪后INF-γ水平变化 | 第89页 |
| 3 讨论 | 第89-92页 |
| ·仔猪免疫pCI-ORF3、pCI-ORF4、pCI-ORF5、pCI-ORF6基因疫苗后外周血淋巴细胞动态变化 | 第90-91页 |
| ·基因疫苗免疫仔猪后外周血IL-2、IL-4及INF-γ水平变化 | 第91-92页 |
| 4 小结 | 第92-93页 |
| 全文总结论 | 第93-94页 |
| 本研究的创新点 | 第94-95页 |
| 参考文献 | 第95-105页 |
| 致谢 | 第105-106页 |
| 个人简介 | 第106-107页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第107页 |
