| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 简写 | 第13-17页 |
| 第一章 绪论 | 第17-27页 |
| 1.1 TRAIL凋亡通路及其死亡受体复合物DISC | 第18-20页 |
| 1.2 Procaspase8蛋白质结构与功能 | 第20-21页 |
| 1.3 REFI技术 | 第21-22页 |
| 1.4 本实验研究的目的 | 第22-24页 |
| 1.5 本实验研究路线 | 第24-27页 |
| 1.5.1 构建载体 | 第24-25页 |
| 1.5.2 转染并筛选细胞株 | 第25页 |
| 1.5.3 细胞系的鉴定 | 第25-27页 |
| 第二章 Procaspase8-D-GFP细胞系的构建 | 第27-58页 |
| 2.1 实验材料 | 第27-32页 |
| 2.1.1 载体、菌种及细胞 | 第27页 |
| 2.1.2 实验仪器和耗材 | 第27-28页 |
| 2.1.3 实验试剂和药品 | 第28-29页 |
| 2.1.4 实验试剂的配置 | 第29-32页 |
| 2.2 实验内容与结果 | 第32-56页 |
| 2.2.1 分子实验 | 第32-38页 |
| 2.2.1.1 获取目的基因procaspase8-D(1-215) | 第32-33页 |
| 2.2.1.2 质粒扩增 | 第33-35页 |
| 2.2.1.3 质粒小提 | 第35页 |
| 2.2.1.4 双酶切鉴定 | 第35-36页 |
| 2.2.1.5 测序鉴定 | 第36页 |
| 2.2.1.6 质粒大提 | 第36-38页 |
| 2.2.2 细胞实验 | 第38-56页 |
| 2.2.2.1 U2OS细胞复苏 | 第38页 |
| 2.2.2.2 U2OS细胞传代 | 第38-39页 |
| 2.2.2.3 质粒pCMV6-Procaspase8-D-GFP转染 | 第39-42页 |
| 2.2.2.4 pCMV6-Procaspase8-D-GFP质粒浓度对转染影响 | 第42-45页 |
| 2.2.2.5 Necrostatin(40uM)预处理U2OS细胞后转染pCMV6-Procaspase8-D-GFP质粒 | 第45-46页 |
| 2.2.2.6 Z-VAD-FMK预处理U2OS细胞后转pCMV6-Procaspase8-D-GFP质粒 | 第46-49页 |
| 2.2.2.7 Procaspase8-D(1-215)对癌细胞的致死作用机制 | 第49-56页 |
| 2.4 小结 | 第56-57页 |
| 2.5 讨论 | 第57-58页 |
| 第三章 Procaspase 8~(WT)细胞系的构建 | 第58-78页 |
| 3.1 实验材料 | 第58-60页 |
| 3.1.1 载体、菌种及细胞 | 第58页 |
| 3.1.2 实验仪器 | 第58-59页 |
| 3.1.3 实验试剂和药品 | 第59页 |
| 3.1.4 实验试剂的配置 | 第59-60页 |
| 3.2 实验内容与结果 | 第60-77页 |
| 3.2.1 分子实验 | 第60-67页 |
| 3.2.1.1 引物设计 | 第60-61页 |
| 3.2.1.2 配置引物 | 第61页 |
| 3.2.1.3 提取total RNA | 第61-62页 |
| 3.2.1.2 逆转录 | 第62-65页 |
| 3.2.1.4 双酶切反应 | 第65-66页 |
| 3.2.1.5 目标片段procaspase8和线性空载质粒胶回收 | 第66页 |
| 3.2.1.6 连接反应 | 第66页 |
| 3.2.1.7 连接载体的转化 | 第66页 |
| 3.2.1.8 菌落PCR | 第66-67页 |
| 3.2.1.9 测序及保菌 | 第67页 |
| 3.2.1.10 质粒大提 | 第67页 |
| 3.2.1.11 点突变 | 第67页 |
| 3.2.2 细胞实验 | 第67-77页 |
| 3.2.2.1 细胞培养 | 第67-68页 |
| 3.2.2.2 pCMV6-procaspase8~(WT)-GFP质粒的转染 | 第68-69页 |
| 3.2.2.3 pCMV6-Procaspase8~(C330A)-GFP质粒的转染 | 第69-77页 |
| 3.5 小结 | 第77-78页 |
| 第四章 prc8DED1-GFP和prc8DED2-GFP细胞系的构建 | 第78-97页 |
| 4.1 实验材料 | 第78-81页 |
| 4.1.1 载体、菌种及细胞 | 第78页 |
| 4.1.2 实验仪器 | 第78-79页 |
| 4.1.3 实验试剂和药品 | 第79页 |
| 4.1.4 实验试剂和药品 | 第79-80页 |
| 4.1.5 实验试剂的配置 | 第80-81页 |
| 4.2 实验内容与结果 | 第81-96页 |
| 4.2.1 分子实验 | 第81-84页 |
| 4.2.1.1 设计引物 | 第81页 |
| 4.2.1.2 配置引物 | 第81-82页 |
| 4.2.1.3 PCR反应 | 第82页 |
| 4.2.1.4 胶回收 | 第82-83页 |
| 4.2.1.5 双酶切反应 | 第83页 |
| 4.2.1.6 目标片段prc8DED1/prc8DED2和线性空载质粒胶回收 | 第83-84页 |
| 4.2.1.7 连接反应 | 第84页 |
| 4.2.1.8 表达载体的转化 | 第84页 |
| 4.2.1.9 菌落PCR | 第84页 |
| 4.2.1.10 测序及保菌 | 第84页 |
| 4.2.2 细胞实验 | 第84-96页 |
| 4.2.2.1 pCMV6-prc8DED1-GFP和pCMV6-prc8DED2-GFP质粒转染 | 第84-86页 |
| 4.2.2.2 细胞系的筛选和建立 | 第86-90页 |
| 4.2.2.3 TRAIL处理细胞系 | 第90-96页 |
| 4.5 小结 | 第96-97页 |
| 第五章 总结与讨论 | 第97-99页 |
| 参考文献 | 第99-104页 |
| 致谢 | 第104-105页 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 | 第105-106页 |
| 附录B 其他需要说明的内容 | 第106页 |
