| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 1 前言 | 第10-25页 |
| 1.1 研究背景及意义 | 第10页 |
| 1.2 巴西橡胶树概述及乳管分化机制和胶乳产生途径 | 第10-13页 |
| 1.2.1 巴西橡胶树形态学概述 | 第10-11页 |
| 1.2.2 巴西橡胶树乳管形成及分化概述 | 第11-12页 |
| 1.2.3 胶乳合成途径 | 第12-13页 |
| 1.3 茉莉酸促进橡胶树乳管分化机制的概述 | 第13-17页 |
| 1.3.1 茉莉酸及其衍生物概述 | 第13-14页 |
| 1.3.2 茉莉酸的生物合成 | 第14-15页 |
| 1.3.3 茉莉酸的代谢 | 第15页 |
| 1.3.4 茉莉酸信号转导途径 | 第15-16页 |
| 1.3.5 茉莉酸与胶乳产量之间的关系 | 第16-17页 |
| 1.4 互作蛋白筛选研究技术原理 | 第17-18页 |
| 1.5 酵母双杂交技术概述 | 第18-20页 |
| 1.5.1 酵母双杂技术原理 | 第18-19页 |
| 1.5.2 酵母双杂系统构成和操作 | 第19页 |
| 1.5.3 酵母双杂技术优势及局限性分析 | 第19-20页 |
| 1.6 酵母单杂技术 | 第20-21页 |
| 1.7 转录因子概述 | 第21-22页 |
| 1.7.1 转录因子的概念及研究现状 | 第21页 |
| 1.7.2 转录因子与生长发育的关系 | 第21-22页 |
| 1.8 NAC转录因子概述 | 第22-24页 |
| 1.8.1 NAC转录因子的结构及发现途径 | 第22-23页 |
| 1.8.2 NAC转录因子的研究现状及其生物学功能研究 | 第23-24页 |
| 1.9 本实验的目的意义及技术路线 | 第24-25页 |
| 2 材料与方法 | 第25-47页 |
| 2.1 材料与试剂 | 第25-26页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第25页 |
| 2.1.2 菌株 | 第25页 |
| 2.1.3 载体 | 第25页 |
| 2.1.4 试剂及工具酶 | 第25-26页 |
| 2.2 实验方法 | 第26-47页 |
| 2.2.1 橡胶HbNAC1基因的生物学克隆 | 第26-33页 |
| 2.2.1.1 橡胶叶片RNA的提取 | 第26-27页 |
| 2.2.1.2 橡胶叶片RNA提取后电泳检测 | 第27-28页 |
| 2.2.1.3 橡胶叶片RNA提取后浓度的测定 | 第28页 |
| 2.2.1.4 RNA样品的纯化 | 第28-29页 |
| 2.2.1.5 RNA反转录合成cDNA | 第29页 |
| 2.2.1.6 HbNAC1转录因子基因的克隆获取 | 第29-33页 |
| 2.2.2 橡胶HbNAC1基因和cDNA基因的半定量RT-PCR表达分析 | 第33-34页 |
| 2.2.2.1 半定量RT-PCR实验前准备 | 第33页 |
| 2.2.2.2 相关基因半定量RT-PCR检测 | 第33-34页 |
| 2.2.3 橡胶HbNAC1基因酵母双杂鉴定 | 第34-40页 |
| 2.2.3.1 不同长度的HbNACl基因PCR扩增及酶切 | 第34-36页 |
| 2.2.3.2 载体pBD-GAL4及pGADT_7-Rec2的双酶切实验 | 第36-37页 |
| 2.2.3.3 构建pBD-GAL4相关的表达载体及pGADT_7-Rec2-HbNAC1载体 | 第37页 |
| 2.2.3.4 酵母感受态的制备及高效转化实验 | 第37-39页 |
| 2.2.3.5 酵母菌融合表达 | 第39-40页 |
| 2.2.3.6 自激活检测及酵母双杂交分析 | 第40页 |
| 2.2.4 橡胶HbNAC1基因原核表达及其纯化 | 第40-44页 |
| 2.2.4.1 原核表达载体的构建 | 第40-42页 |
| 2.2.4.2 融合表达载体pGEX-6p-1-HbNAC1转化BL21感受态细胞 | 第42页 |
| 2.2.4.3 原核表达实验 | 第42-43页 |
| 2.2.4.4 蛋白纯化实验 | 第43页 |
| 2.2.4.5 EMSA实验 | 第43-44页 |
| 2.2.5 过度表达和转录抑制表达分析HbNAC1基因 | 第44-47页 |
| 2.2.5.1 克隆插入片段HbNAC1基因及HbNAC1-RSDX基因 | 第44页 |
| 2.2.5.2 pBI121载体图谱及酶切 | 第44-45页 |
| 2.2.5.3 酶切后连接及转化实验 | 第45页 |
| 2.2.5.4 pBI121-HbNACl与pBI121-HbNAC1-RSDX转化农杆菌 | 第45-46页 |
| 2.2.5.5 农杆菌转化后菌液PCR鉴定 | 第46页 |
| 2.2.5.6 农杆菌侵染烟草 | 第46-47页 |
| 3 结果与分析 | 第47-60页 |
| 3.1 橡胶树叶片RNA的提取 | 第47页 |
| 3.2 PCR扩增全长HbNAC1基因 | 第47-49页 |
| 3.2.1 PCR扩增HbNAC1基因 | 第47-48页 |
| 3.2.2 橡胶HbNAC1基因与其他植物的NAC基因同源比较 | 第48-49页 |
| 3.3 半定量RT-PCR的表达分析 | 第49页 |
| 3.4 HbNAC1基因自身形成二聚体的验证分析 | 第49-53页 |
| 3.4.1 不同长度的HbNAC1基因表达载体构建 | 第49-50页 |
| 3.4.2 不同浓度梯度3-AT抑制本体表达研究 | 第50-51页 |
| 3.4.3 酵母双杂验证HbNAC1转录因子间的互作结构域 | 第51-53页 |
| 3.4.3.1 载体pGADT7-Rec2-HbNAC1的构建 | 第51-52页 |
| 3.4.3.2 HbNAC1转录因子间的互作结构域验证 | 第52-53页 |
| 3.5 HbNAC1与胶乳合成基因启动子间互作分析 | 第53-55页 |
| 3.5.1 携带橡胶合成相关基因不同启动子的pHIS2-1载体转录自激活检测 | 第53-54页 |
| 3.5.2 酵母单杂交验证HbNAC1蛋白的与哪些橡胶合成相关基因启动子互作 | 第54-55页 |
| 3.6 HbNAC1蛋白纯化分析 | 第55-57页 |
| 3.6.1 原核表达筛选条件 | 第55-56页 |
| 3.6.2 原核表达的蛋白洗脱纯化 | 第56-57页 |
| 3.7 过度表达和转录抑制表达HbNAC1基因 | 第57-60页 |
| 3.7.1 构建HbNAC1基因过度表达和转录抑制表达载体 | 第57-58页 |
| 3.7.2 植物表达载体的农杆菌转化 | 第58-59页 |
| 3.7.3 转基因烟草DNA提取后的PCR检测 | 第59-60页 |
| 3.7.4 烟草阳性转化株的叶片GUS染色实验 | 第60页 |
| 4 讨论 | 第60-61页 |
| 5 结论 | 第61-63页 |
| 参考文献 | 第63-67页 |
| 附录 | 第67-70页 |
| 致谢 | 第70页 |
