| 摘要 | 第11-14页 |
| Abstract | 第14-16页 |
| 缩略词表Abbreiation | 第17-19页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-33页 |
| 1. 解没食子酸链球菌的概述 | 第19-24页 |
| 1.1 解没食子酸链球菌的分类 | 第19页 |
| 1.2 解没食子酸链球菌的生物学特性 | 第19-20页 |
| 1.2.1 形态学 | 第19-20页 |
| 1.2.2 培养与生化特性 | 第20页 |
| 1.3 解没食子酸链球菌的流行病学 | 第20-22页 |
| 1.4 解没食子酸链球菌巴氏亚种的基因组学研究 | 第22页 |
| 1.5 解没食子酸链球菌的致病机制 | 第22-23页 |
| 1.5.1 解没食子酸链球菌的毒力 | 第22-23页 |
| 1.5.2 解没食子酸链球菌与巨噬细胞的相互作用 | 第23页 |
| 1.6 细胞坏死性凋亡的研究进展 | 第23-24页 |
| 2. 细菌耐药性现状 | 第24-33页 |
| 2.1 大环内酯药物作用的结构基础 | 第24-27页 |
| 2.1.1 靶标肽酰tRNA转移酶中心 | 第26页 |
| 2.1.2 靶标核糖体的出口隧道 | 第26-27页 |
| 2.2 抗生素耐药机制 | 第27-28页 |
| 2.3 大环内酯类耐药机制 | 第28-33页 |
| 2.3.1 红霉素耐药甲基化酶的概述 | 第29-30页 |
| 2.3.2 核糖体停靠机制 | 第30页 |
| 2.3.3 Leader peptide对大环内酯耐药的作用机制 | 第30-33页 |
| 本研究的目的与意义 | 第33-34页 |
| 第二章 解没食子酸链球菌巴氏亚种的分离鉴定 | 第34-48页 |
| 1 试验材料 | 第34-36页 |
| 1.1 病料来源 | 第34页 |
| 1.2 试验动物 | 第34-35页 |
| 1.3 主要试剂 | 第35页 |
| 1.4 主要仪器 | 第35页 |
| 1.5 培养基的配制及主要试剂的配方 | 第35-36页 |
| 2 试验方法 | 第36-42页 |
| 2.1 分离株AL101002菌株的纯化培养 | 第36页 |
| 2.2 六株分离菌株的微生物学鉴定 | 第36-38页 |
| 2.2.1 六株分离菌株的形态特征 | 第36页 |
| 2.2.2 六株分离菌株的生长特性 | 第36页 |
| 2.2.3 六株分离菌株的溶血特性 | 第36页 |
| 2.2.4 六株分离菌株的生化特性 | 第36-38页 |
| 2.2.4.1 常规生化特性鉴定 | 第36-37页 |
| 2.2.4.2 ATB自动生化特性鉴定 | 第37-38页 |
| 2.3 六株分离菌株的血清学分型鉴定 | 第38-39页 |
| 2.4 六株分离菌株的 16S r RNA基因鉴定 | 第39页 |
| 2.4.1 六株分离菌株基因组DNA的提取 | 第39页 |
| 2.4.2 分离菌株AL101002进化树的构建 | 第39页 |
| 2.5 六株分离菌株药物敏感性试验 | 第39页 |
| 2.6 分离菌株AL101002多克隆抗体的制备 | 第39-40页 |
| 2.6.1 抗原（灭活菌悬液）的制备 | 第39-40页 |
| 2.6.2 抗原的乳化 | 第40页 |
| 2.6.3 免疫方案 | 第40页 |
| 2.6.4 抗体的纯化 | 第40页 |
| 2.7 雏鸭回归试验 | 第40-41页 |
| 2.7.1 试验动物分组及处理 | 第40页 |
| 2.7.2 不同分离菌株雏鸭临床症状的观察 | 第40-41页 |
| 2.7.3 六株分离菌株感染雏鸭的剖检病变及样品的采集 | 第41页 |
| 2.7.4 六株临床分离菌株分别感染雏鸭后各器官的组织学病理变化 | 第41页 |
| 2.7.5 分离菌株AL101002感染雏鸭脾、肝、肾石蜡切片的革兰氏染色 | 第41页 |
| 2.7.6 分离菌株AL101002在雏鸭肝、脾、肾的定位 | 第41页 |
| 2.7.7 分离株AL101002感染雏鸭脾脏的超微结构病理变化 | 第41页 |
| 2.8 菌种保存 | 第41-42页 |
| 3. 试验结果 | 第42-46页 |
| 3.1 自然感染雏鸭的组织学病理变化 | 第42页 |
| 3.2 六株分离菌株形态与生长特性 | 第42页 |
| 3.3 六株分离菌株的生化特性鉴定 | 第42-44页 |
| 3.3.1 常规的生化特性鉴定 | 第42页 |
| 3.3.2 ATB自动生化特性鉴定 | 第42-43页 |
| 3.3.3 六株分离菌株的血清学分型鉴定 | 第43页 |
| 3.3.4 六株分离菌株的快速PCR方法鉴定及进化树的构建 | 第43-44页 |
| 3.4 六株分离菌株的药物敏感性试验结果 | 第44页 |
| 3.5 雏鸭回归试验 | 第44-46页 |
| 3.5.1 从感染雏鸭的不同组织分离纯培养接种菌 | 第44-45页 |
| 3.5.2 雏鸭临床症状观察结果 | 第45页 |
| 3.5.3雏鸭剖检病理变化 | 第45页 |
| 3.5.4 雏鸭组织学病理变化结果 | 第45页 |
| 3.5.5 AL101002菌感染雏鸭脾、肝、肾石蜡切片革兰氏染色结果 | 第45-46页 |
| 3.5.6 AL101002菌在雏鸭体内的分布 | 第46页 |
| 3.5.7 AL101002菌雏鸭脾脏的超微结构病理变化结果 | 第46页 |
| 4 讨论 | 第46-48页 |
| 第三章 解没食子酸链球菌巴氏亚种对雏鸭致病性的动态研究 | 第48-72页 |
| 1. 材料 | 第48-49页 |
| 1.1 试验动物 | 第48页 |
| 1.2 主要仪器设备 | 第48-49页 |
| 1.3 主要试剂 | 第49页 |
| 2. 试验方法 | 第49-54页 |
| 2.1 解没食子酸链球菌巴氏亚种AL101002 菌株的复苏 | 第49页 |
| 2.2 试验动物分组及处理 | 第49页 |
| 2.3 感染AL101002菌株雏鸭临床症状的观察 | 第49-50页 |
| 2.4 试验样品的采集与保存 | 第50页 |
| 2.5 感染AL101002菌株雏鸭各脏器及血液细菌的分离 | 第50页 |
| 2.6 感染AL101002菌株雏鸭的组织学病理变化动态观察 | 第50页 |
| 2.7 感染AL101002菌株雏鸭的免疫器官指数测定 | 第50页 |
| 2.8 实时荧光定量RT-PCR检测雏鸭脾和脑炎症因子及脾脏坏死性凋亡相关因子的表达量 | 第50-54页 |
| 2.8.1 组织总RNA的提取 | 第50-51页 |
| 2.8.2 试验用引物 | 第51-52页 |
| 2.8.3 PCR扩增检测目的基因的CDNA | 第52-53页 |
| 2.8.4 实时荧光定量PCR扩增目的基因 | 第53-54页 |
| 2.9 数据分析 | 第54页 |
| 3 试验结果 | 第54-66页 |
| 3.1 AL101002菌株感染雏鸭临床症状观察结果 | 第54-55页 |
| 3.2 AL101002菌株感染雏鸭的剖检病理变化结果 | 第55-57页 |
| 3.2.1 A组雏鸭剖检病理变化结果 | 第55-56页 |
| 3.2.2 B组雏鸭剖检病理变化结果 | 第56-57页 |
| 3.3 AL101002菌株感染雏鸭各器官及血液的细菌分离结果 | 第57-58页 |
| 3.3.1 A组雏鸭血液和各器官细菌分离结果 | 第57页 |
| 3.3.2 B组雏鸭各器官细菌分离结果 | 第57-58页 |
| 3.4 AL101002菌株感染雏鸭的组织学病理变化结果 | 第58-61页 |
| 3.5 AL101002菌株感染雏鸭后脾脏组织的抗原定位 | 第61-62页 |
| 3.6 AL101002菌株感染雏鸭的免疫器官指数测定 | 第62页 |
| 3.7 AL101002菌株感染雏鸭脾脏的超微组织学病理变化动态观察 | 第62-63页 |
| 3.8 AL101002菌株感染雏鸭后脾脏组织的凋亡染色 | 第63页 |
| 3.9 脾脏巨噬细胞表面标记CD68免疫组织化学染色 | 第63-64页 |
| 3.10 实时荧光定量检测脾和脑相关因子的m RNA表达量 | 第64-66页 |
| 3.10.1 组织总RNA的提取结果 | 第64页 |
| 3.10.2 琼脂糖凝胶电泳检测相关基因的扩增结果 | 第64页 |
| 3.10.3 实时荧光定量检测目的基因的结果 | 第64-66页 |
| 4 讨论 | 第66-72页 |
| 4.1 AL101002菌株感染雏鸭临床症状及病理变化的动态观察 | 第66-67页 |
| 4.2 AL101002在各器官及血液分布的动态观察 | 第67-68页 |
| 4.3 脾脏的TUNE L染色 | 第68页 |
| 4.4 脾脏的超微组织学病理变化的动态观察 | 第68-69页 |
| 4.5 AL101002菌株感染雏鸭脾脏Caspase3、Caspase8、RIPK1、RIPK2-like、M LKL的m RNA表达量的动态观察 | 第69-70页 |
| 4.6 AL101002菌 株感染雏鸭脑、脾炎性因子m RNA表 达量的动观察 | 第70-72页 |
| 第四章 解没食子酸链球菌巴氏亚种大环内酯耐药机制研究 | 第72-117页 |
| 1 试验材料 | 第72-78页 |
| 1.1 主要试剂 | 第72页 |
| 1.2 主要仪器 | 第72-73页 |
| 1.3 培养基的配置 | 第73页 |
| 1.4 主要缓冲液的制备 | 第73-74页 |
| 1.5 抗生素贮存液的配置 | 第74-75页 |
| 1.6 质粒载体 | 第75-78页 |
| 2. 试验方法 | 第78-99页 |
| 2.1 六株解没食子酸链球菌巴氏亚种的复苏 | 第78页 |
| 2.2 解没食子酸链球菌巴氏亚种基因组的提取 | 第78页 |
| 2.3 引物的设计与合成 | 第78-85页 |
| 2.4 临床耐药菌株的MIC值检测（琼脂稀释法） | 第85页 |
| 2.5 六株菌的质粒提取及相关耐药基因的扩增 | 第85-86页 |
| 2.6 核糖体蛋白L4和L22的检测 | 第86页 |
| 2.7 23S rRNA的扩增 | 第86页 |
| 2.8 解没食子酸链球菌巴氏亚种的外排泵抑制试验 | 第86页 |
| 2.9 耐药基因ermB和ermT的上下游序列扩增 | 第86-88页 |
| 2.10 erm基因的克隆 | 第88-93页 |
| 2.10.1 ERMB和ERMT分别克隆至PET28A表达载体 | 第88页 |
| 2.10.2 分别克隆ERMBL和ERMTL至PET28A表达载体 | 第88-89页 |
| 2.10.3 分别构建ERMT和ERMTL至PHT01载体 | 第89页 |
| 2.10.4 ERMBL和ERMTL分别构建至PET21A载体 | 第89页 |
| 2.10.5 ERMT，ERMTL及ERMTL+30BP分别构建至克隆载体PSET2 | 第89页 |
| 2.10.6 克隆操作步骤 | 第89-93页 |
| 2.11 红霉素诱导表达ermB和ermT基因的验证 | 第93-96页 |
| 2.11.1 ERMB和ERMT基因的MRNA表达水平 | 第93页 |
| 2.11.2 WESTERN BLOT检测ERMB和ERMT蛋白的表达 | 第93-96页 |
| 2.11.2.1 ERMB和ERMT蛋白在红霉素存在与否时，在亲本株的表达情况 | 第93-94页 |
| 2.11.2.2 加红霉素时，ERMB和ERMT蛋白在大肠杆菌的表达情况 | 第94-96页 |
| 2.12 在E．coli验证erm基因对大环内酯类药物及林可酰胺类抗生素的耐药贡献 | 第96页 |
| 2.13 耐药基因ermB和ermT的序列分析 | 第96页 |
| 2.14 23S rRNA构建至pUC19载体上 | 第96页 |
| 2.15 ermB基因和23S rRNA突变位点的构建及MIC值的检测 | 第96-97页 |
| 2.16 ermT基因上游leader peptide之前的30bp碱基的功能验证 | 第97-98页 |
| 2.17 AL101002菌株的全基因组测序 | 第98页 |
| 2.18 基因预测 | 第98-99页 |
| 3. 结果与分析 | 第99-114页 |
| 3.1 临床耐药菌株MIC值的检测结果 | 第99-100页 |
| 3.2 临床耐药菌株质粒检测及相关耐药基因的扩增 | 第100页 |
| 3.3 rplD，rplV和 23S rRNA基因扩增与序列分析 | 第100-101页 |
| 3.4 外排泵抑制剂对六株菌的外排泵抑制作用 | 第101-102页 |
| 3.5 耐药基因ermB和ermT的上下游序列扩增 | 第102-103页 |
| 3.6 红霉素诱导表达ErmB和ErmT蛋白的验证 | 第103-106页 |
| 3.6.1 ERMB和ERMT基因MRNA表达水平的检测 | 第103-104页 |
| 3.6.2 ERMB和ERMT蛋白的表达和多克隆抗体的制备 | 第104-106页 |
| 3.6.2.1 ERMB和ERMT蛋白的原核表达 | 第104-105页 |
| 3.6.2.2 多克隆抗体的制备 | 第105页 |
| 3.6.2.3 ERMB和ERMT蛋白的WESTERN BLOT检测 | 第105-106页 |
| 3.6.2.3.1 在亲本菌株中验证ERMB和ERMT蛋白的表达 | 第105页 |
| 3.6.2.3.2 在大肠杆菌中验证ERMB和ERMT蛋白的表达 | 第105-106页 |
| 3.7 ermB和ermT基因致大环内酯类药物高水平耐药 | 第106-107页 |
| 3.8 ermB和ermT基因突变位点检测及对大环内酯的耐药贡献 | 第107-108页 |
| 3.8.1 六株临床菌株ERMB和ERMT序列的测序 | 第107-108页 |
| 3.8.2 克隆含有ERMB突变位点的序列至PET28A载体 | 第108页 |
| 3.8.3 检测ERMB基因氨基酸突变位点对大环内酯类药物的耐药贡献 | 第108页 |
| 3.9 erm基因与23S rRNA对大环内酯的共同贡献 | 第108-110页 |
| 3.10 ermTL基因的上游插入30bp序列 | 第110-111页 |
| 3.11 验证ermTL上游的30bp序列是否为启动子序列 | 第111页 |
| 3.12 全基因组测序结果 | 第111-114页 |
| 3.12.1 AL101002基因组的基本信息 | 第111-112页 |
| 3.12.2 AL101002基因组序列与NR库比对结果 | 第112页 |
| 3.12.3 AL101002全基因组共线性比较分析 | 第112-113页 |
| 3.12.4 AL101002预测基因与ARDB数据库的比对结果 | 第113-114页 |
| 4. 讨论 | 第114-117页 |
| 全文总结 | 第117-118页 |
| 图版说明 | 第118-136页 |
| 第一章 | 第118-123页 |
| 第二章 | 第123-130页 |
| 第三章 | 第130-136页 |
| 参考文献 | 第136-149页 |
| 致谢 | 第149-150页 |
| 附录 博士期间发表及收录文章 | 第150-152页 |
