| 摘要 | 第9-10页 |
| ABSTRACT | 第10-11页 |
| 1 前言 | 第12-23页 |
| 1.1 RNAi研究进展 | 第12-16页 |
| 1.1.1 RNAi的作用机制 | 第12-13页 |
| 1.1.2 RNAi的作用特点 | 第13-14页 |
| 1.1.3 siRNA的制备 | 第14-15页 |
| 1.1.4 RNAi技术的研究概况 | 第15-16页 |
| 1.1.4.1 RNAi技术在动物医学研究中应用 | 第15页 |
| 1.1.4.2 RNAi技术在植物研究中应用 | 第15-16页 |
| 1.2 RNAi技术在昆虫研究中的应用 | 第16-19页 |
| 1.2.1 RNAi技术在昆虫功能基因研究的应用 | 第16-18页 |
| 1.2.2 RNAi技术在抗药性研究中的应用 | 第18页 |
| 1.2.3 RNAi技术在害虫防治中的应用 | 第18-19页 |
| 1.3 小菜蛾研究进展 | 第19-21页 |
| 1.3.1 小菜蛾的起源及分布 | 第19页 |
| 1.3.2 小菜蛾的危害 | 第19-20页 |
| 1.3.3 小菜蛾的防治 | 第20-21页 |
| 1.3.4 RNAi技术在小菜蛾中的应用 | 第21页 |
| 1.4 本研究的目的及意义 | 第21-23页 |
| 2 材料与方法 | 第23-38页 |
| 2.1 主要仪器设备 | 第23页 |
| 2.2 药品与试剂 | 第23-26页 |
| 2.2.1 主要药品 | 第23-24页 |
| 2.2.2 常用试剂的配制 | 第24-25页 |
| 2.2.3 引物设计与合成 | 第25-26页 |
| 2.3 小菜蛾的饲养 | 第26页 |
| 2.4 小菜蛾总RNA的提取 | 第26-27页 |
| 2.5 编码小菜蛾JHE底物结合位点区域DNA片段的dsRNA的合成 | 第27-31页 |
| 2.5.1 编码小菜蛾JHE底物结合位点区域DNA目的片段的dsRNA的合成 | 第27-29页 |
| 2.5.1.1 目的片段cDNA的扩增 | 第27-28页 |
| 2.5.1.2 目的产物的扩增 | 第28页 |
| 2.5.1.3 RT-PCR的反应条件的优化 | 第28-29页 |
| 2.5.2 双链DNA片段的回收 | 第29-30页 |
| 2.5.3 dsRNA的合成 | 第30-31页 |
| 2.5.3.1 dsRNA的扩增 | 第30页 |
| 2.5.3.2 dsRNA的纯化 | 第30-31页 |
| 2.5.3.3 dsRNA合成较优温度的设定 | 第31页 |
| 2.5.3.4 dsRNA合成最佳时间的设定 | 第31页 |
| 2.6 编码小菜蛾JHE催化位点区域DNA片段的dsRNA的合成 | 第31-32页 |
| 2.6.1 编码小菜蛾JHE催化位点区域DNA片段的扩增 | 第31-32页 |
| 2.6.1.1 cDNA目的片段的获得 | 第31页 |
| 2.6.1.2 RT-PCR的反应条件的优化 | 第31-32页 |
| 2.6.1.3 双链cDNA片段的回收 | 第32页 |
| 2.6.2 dsRNA的扩增 | 第32页 |
| 2.6.2.1 dsRNA的合成及扩增体系 | 第32页 |
| 2.6.2.2 dsRNA合成较优温度的设定 | 第32页 |
| 2.6.2.3 dsRNA合成最佳时间的设定 | 第32页 |
| 2.7 保幼激素酯酶酶原的制备 | 第32-33页 |
| 2.8 保幼激素酯酶酶原蛋白含量的测定 | 第33-34页 |
| 2.8.1 蛋白质标准曲线的制作 | 第33页 |
| 2.8.2 保幼激素酯酶酶原蛋白含量的测定 | 第33-34页 |
| 2.9 保幼激素酯酶活性的测定 | 第34-35页 |
| 2.9.1 谷胱甘肽标准曲线的制作 | 第34页 |
| 2.9.2 保幼激素酯酶活性的测定 | 第34-35页 |
| 2.10 DEPC处理水对小菜蛾3龄幼虫的毒力测定 | 第35页 |
| 2.11 dsRNA对小菜蛾保幼激素酯酶的沉默效应 | 第35-36页 |
| 2.11.1 编码JHE底物结合位点区域DNA片段的沉默 | 第35-36页 |
| 2.11.1.1 dsRNA实验浓度的设定 | 第35页 |
| 2.11.1.2 dsRNA沉默效应的检测 | 第35-36页 |
| 2.11.1.3 饲喂dsRNA对小菜蛾JHE活性的影响 | 第36页 |
| 2.11.2 编码JHE催化位点区域DNA片段的沉默 | 第36页 |
| 2.11.2.1 dsRNA实验浓度的设定 | 第36页 |
| 2.11.2.2 dsRNA沉默效应的检测 | 第36页 |
| 2.12 3-辛基-1,1,1-三氟-2-丙酮(OTFP)对小菜蛾4龄幼虫的影响 | 第36-38页 |
| 2.12.1 OTFP对甘蓝叶碟的影响 | 第36页 |
| 2.12.2 OTFP浓度的设定 | 第36页 |
| 2.12.3 OTFP对小菜蛾4龄幼虫生长发育的影响 | 第36-37页 |
| 2.12.4 OTFP对小菜蛾4龄幼虫JHE活性的影响 | 第37-38页 |
| 2.12.4.1 OTFP对小菜蛾4龄幼虫JHE活体活性的影响 | 第37页 |
| 2.12.4.2 OTFP对小菜蛾4龄JH离体活性的影响 | 第37-38页 |
| 2.13 显著性检验 | 第38页 |
| 3 结果与分析 | 第38-61页 |
| 3.1 小菜蛾RNA的提取 | 第38-39页 |
| 3.1.1 小菜蛾总RNA的完整性 | 第38-39页 |
| 3.1.2 小菜蛾总RNA浓度 | 第39页 |
| 3.2 编码JHE底物结合位点区域DNA片段的dsRNA的合成 | 第39-44页 |
| 3.2.1 目的片段DNA的电泳 | 第39-40页 |
| 3.2.2 目的片段DNA的最佳退火温度 | 第40页 |
| 3.2.3 RT-PCR扩增产物的测序 | 第40-41页 |
| 3.2.4 双链DNA片段的回收 | 第41-42页 |
| 3.2.5 dsRNA的合成 | 第42-44页 |
| 3.2.5.1 dsRNA的完整性 | 第42页 |
| 3.2.5.2 dsRNA合成的较适温度 | 第42-43页 |
| 3.2.5.3 dsRNA合成的最佳时间 | 第43-44页 |
| 3.3 编码JHE催化功能位点区域DNA片段的dsRNA的合成 | 第44-48页 |
| 3.3.1 目的片段DNA的电泳 | 第44-45页 |
| 3.3.2 目的片段DNA的最佳退火温度 | 第45-46页 |
| 3.3.3 RT-PCR扩增产物的测序 | 第46-47页 |
| 3.3.4 目的片段DNA的回收 | 第47页 |
| 3.3.5 dsRNA的合成 | 第47-48页 |
| 3.3.5.1 dsRNA合成的较适温度 | 第47-48页 |
| 3.3.5.2 dsRNA合成的最佳时间 | 第48页 |
| 3.4 蛋白的标准曲线 | 第48-49页 |
| 3.5 酶活反应的标准曲线 | 第49页 |
| 3.6 DEPC处理水对小菜蛾3龄幼虫的生长发育的影响 | 第49-52页 |
| 3.6.1 DEPC处理水对小菜蛾3龄幼虫的毒力 | 第49-50页 |
| 3.6.2 DEPC处理水对小菜蛾3龄幼虫幼虫生长发育的影响 | 第50-52页 |
| 3.7 dsRNA的沉默效应 | 第52-55页 |
| 3.7.1 编码JHE底物结合位点区域DNA片段的沉默 | 第52-54页 |
| 3.7.1.1 dsRNA对小菜蛾存活的影响 | 第52页 |
| 3.7.1.2 dsRNA对小菜蛾生长发育的影响 | 第52-53页 |
| 3.7.1.3 饲喂dsRNA对小菜蛾3龄幼虫JHE酶活性的影响 | 第53-54页 |
| 3.7.2 编码JHE催化位点区域的RNA的沉默效应 | 第54-55页 |
| 3.8 OTFP对小菜蛾4龄幼虫的影响 | 第55-61页 |
| 3.8.1 OTFP对甘蓝叶碟的影响 | 第55页 |
| 3.8.2 OTFP对小菜蛾4龄幼虫的毒力 | 第55-56页 |
| 3.8.3 OTFP对小菜蛾4龄幼虫生长发育的影响 | 第56-58页 |
| 3.8.4 OTFP对小菜蛾化蛹的影响 | 第58-59页 |
| 3.8.4.1 小菜蛾的化蛹率 | 第58页 |
| 3.8.4.2 小菜蛾的化蛹时间 | 第58-59页 |
| 3.8.5 OTFP对小菜蛾4龄幼虫JHE活性的影响 | 第59-61页 |
| 3.8.5.1 OTFP对小菜蛾4龄幼虫JHE活体抑制 | 第59-60页 |
| 3.8.5.2 OTFP对小菜蛾JHE的离体抑制 | 第60-61页 |
| 4 讨论与结论 | 第61-66页 |
| 4.1 讨论 | 第61-64页 |
| 4.1.1 总RNA提取方法的选择 | 第61页 |
| 4.1.2 dsRNA的合成 | 第61-62页 |
| 4.1.3 DEPC处理水对小菜蛾的毒力 | 第62页 |
| 4.1.4 RNAi效率的影响因素 | 第62-63页 |
| 4.1.4.1 dsRNA的摄入方式 | 第62页 |
| 4.1.4.2 dsRNA的特征 | 第62-63页 |
| 4.1.4.3 试虫前期处理 | 第63页 |
| 4.1.5 小菜蛾保幼激素酯酶的RNA干扰 | 第63-64页 |
| 4.1.6 OTFP对小菜蛾JHE的影响 | 第64页 |
| 4.2 结论 | 第64-66页 |
| 参考文献 | 第66-74页 |
| 致谢 | 第74页 |
