| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 第一章 绪论 | 第13-27页 |
| 1.1 引言 | 第13-14页 |
| 1.2 酿酒酵母中麦角甾醇合成代谢通路简介 | 第14-17页 |
| 1.2.1 甾体类药物生物转化 | 第14-16页 |
| 1.2.2 甾醇C-4 脱甲基反应 | 第16-17页 |
| 1.3 国内外研究现状及发展动态分析 | 第17-24页 |
| 1.3.1 生物法获得甾体类活性药物 | 第17-18页 |
| 1.3.2 甾醇合成的关键酶体系及调控蛋白 | 第18-21页 |
| 1.3.3 Erg28p蛋白在甾醇C-4 脱甲基催化反应中的重要功能及作用机理 | 第21-24页 |
| 1.4 本课题的立题背景、意义及主要研究内容 | 第24-27页 |
| 1.4.1 立题背景和意义 | 第24页 |
| 1.4.2 主要研究内容 | 第24-27页 |
| 1.4.2.1 探讨ERG28基因的缺失对酿酒酵母麦角甾醇合成途径的影响 | 第25页 |
| 1.4.2.2 明确Erg28p蛋白在甾醇C-4 脱甲基多酶体系中的生物学功能 | 第25页 |
| 1.4.2.3 确定甾醇C-4 脱甲基多酶体系中Erg28p蛋白的关键作用残基 | 第25-27页 |
| 第二章 ERG28基因敲除及回复表达细胞模型的建立 | 第27-41页 |
| 2.1 引言 | 第27页 |
| 2.2 实验材料 | 第27-30页 |
| 2.2.1 菌株及常用质粒载体 | 第27-28页 |
| 2.2.2 常用酶及试剂 | 第28-29页 |
| 2.2.3 培养基 | 第29-30页 |
| 2.3 实验仪器 | 第30页 |
| 2.4 方法 | 第30-37页 |
| 2.4.1 酵母菌的活化 | 第30页 |
| 2.4.2 Cre-loxP体系建立BY4741/ΔERG28酿酒酵母细胞模型 | 第30-35页 |
| 2.4.2.1 敲除盒的构建 | 第32-34页 |
| 2.4.2.2 醋酸锂法转染酿酒酵母 | 第34页 |
| 2.4.2.3 PCR鉴定基因敲除酵母转化子 | 第34-35页 |
| 2.4.3 ERG28基因的克隆及回复表达 | 第35-36页 |
| 2.4.3.1 ERG28基因表达载体的构建 | 第35-36页 |
| 2.4.3.2 回复表达Erg28p酵母菌株的构建 | 第36页 |
| 2.4.4 细胞生长情况测定 | 第36-37页 |
| 2.5 结果与讨论 | 第37-40页 |
| 2.5.1 BY4741/ΔERG28敲除菌的构建 | 第37页 |
| 2.5.2 BY4741/ΔERG28敲除菌的鉴定 | 第37-38页 |
| 2.5.3 ERG28基因的克隆及回复表达菌株的构建 | 第38-39页 |
| 2.5.4 不同遗传背景下ERG28基因工程菌的生长情况 | 第39-40页 |
| 2.5.4.1 菌体干重 | 第39页 |
| 2.5.4.2 外源添加麦角甾醇 | 第39-40页 |
| 2.6 本章小结 | 第40-41页 |
| 第三章 Erg28p蛋白的生物学功能研究 | 第41-57页 |
| 3.1 引言 | 第41页 |
| 3.2 实验材料 | 第41-43页 |
| 3.2.1 菌株及质粒载体 | 第41-42页 |
| 3.2.2 主要实验试剂 | 第42-43页 |
| 3.2.3 培养基 | 第43页 |
| 3.3 实验仪器 | 第43页 |
| 3.4 GC-MS测定不同遗传背景下ERG28基因工程菌的甾醇合成代谢产物 | 第43-45页 |
| 3.4.1 菌体发酵培养 | 第43-44页 |
| 3.4.2 甾醇合成中间体的皂化提取 | 第44-45页 |
| 3.4.3 甾醇合成中间体的含量测定 | 第45页 |
| 3.5 C-4 脱甲基多酶体系的亚细胞定位 | 第45-47页 |
| 3.5.1 C-4 脱甲基多酶体系各亚基的跨膜分析 | 第45-46页 |
| 3.5.2 大肠杆菌表达载体pKT128-ERG的构建 | 第46页 |
| 3.5.3 酿酒酵母表达载体的构建 | 第46-47页 |
| 3.5.4 荧光共聚焦考察融合蛋白的线粒体膜的亚细胞定位 | 第47页 |
| 3.6 结果与讨论 | 第47-55页 |
| 3.6.1 NIST数据库中的质谱鉴定 | 第47-48页 |
| 3.6.2 ERG28的敲除对酿酒酵母麦角甾醇合成代谢的影响 | 第48-52页 |
| 3.6.2.1 野生菌代谢产物的分析 | 第49页 |
| 3.6.2.2 敲除菌代谢产物的分析 | 第49-51页 |
| 3.6.2.3 回复菌代谢产物的分析 | 第51-52页 |
| 3.6.3 Erg28p对C-4 脱甲基多酶体系中其他蛋白定位的影响 | 第52-55页 |
| 3.6.3.1 各亚基的跨膜分析 | 第52页 |
| 3.6.3.2 pKT128-ERG重组质粒的构建 | 第52-53页 |
| 3.6.3.3 Erg28p对Erg26p的细胞定位影响 | 第53-55页 |
| 3.7 本章小结 | 第55-57页 |
| 第四章 Erg28p蛋白的关键作用位点分析 | 第57-73页 |
| 4.1 引言 | 第57页 |
| 4.2 实验材料 | 第57-58页 |
| 4.2.1 菌株及质粒载体 | 第57页 |
| 4.2.2 常用酶及试剂 | 第57-58页 |
| 4.2.3 培养基 | 第58页 |
| 4.3 实验仪器 | 第58页 |
| 4.4 方法 | 第58-60页 |
| 4.4.1 ERG28基因生物信息学分析 | 第58页 |
| 4.4.2 ERG28截短突变体的构建及甾醇合成代谢的检测 | 第58-60页 |
| 4.4.2.1 ERG28截短突变体的构建 | 第58-60页 |
| 4.4.2.2 甾醇合成代谢表型 | 第60页 |
| 4.5 结果与讨论 | 第60-70页 |
| 4.5.1 ERG28截短表达载体的构建 | 第60-61页 |
| 4.5.2 Erg28p截短片段回复表达菌株中甾醇合成代谢表型检测 | 第61-64页 |
| 4.5.3 Erg28p关键作用残基的预测及鉴定 | 第64-70页 |
| 4.5.3.1 同源性分析 | 第64-65页 |
| 4.5.3.2 二级结构分析 | 第65-66页 |
| 4.5.3.3 三维模型分析 | 第66-68页 |
| 4.5.3.4 代谢表型差异分析 | 第68-69页 |
| 4.5.3.5 生长表型差异分析 | 第69-70页 |
| 4.6 本章小结 | 第70-73页 |
| 第五章 总结与展望 | 第73-76页 |
| 5.1 总结 | 第73-74页 |
| 5.2 展望 | 第74-76页 |
| 参考文献 | 第76-85页 |
| 附录 | 第85-87页 |
| 致谢 | 第87页 |
