| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 引言 | 第10-11页 |
| 1 文献综述 | 第11-25页 |
| 1.1 瘦素研究进展 | 第11-14页 |
| 1.1.1 瘦素简介 | 第11页 |
| 1.1.2 瘦素基因 | 第11页 |
| 1.1.3 瘦素的结构及分布 | 第11-13页 |
| 1.1.4 瘦素受体 | 第13-14页 |
| 1.1.5 瘦素的作用机制 | 第14页 |
| 1.1.6 瘦素的功能 | 第14页 |
| 1.2 慢性肾衰竭 | 第14-15页 |
| 1.2.1 慢性肾衰竭简介 | 第14-15页 |
| 1.2.2 瘦素与慢性肾衰竭 | 第15页 |
| 1.3 纳米抗体技术 | 第15-20页 |
| 1.3.1 纳米抗体(Nb)的发现及结构特征 | 第15-17页 |
| 1.3.2 纳米抗体的性质与应用 | 第17-18页 |
| 1.3.3 噬菌体展示技术 | 第18-20页 |
| 1.3.4 纳米抗体的筛选 | 第20页 |
| 1.4 大肠杆菌表达系统 | 第20-24页 |
| 1.4.1 大肠杆菌表达系统的基本原理 | 第20页 |
| 1.4.2 大肠杆菌表达系统基因表达与调控 | 第20-22页 |
| 1.4.3 大肠杆菌表达载体的类型与应用 | 第22-23页 |
| 1.4.4 大肠杆菌中外源基因高效表达策略 | 第23-24页 |
| 1.5 本论文研究目的、内容和意义 | 第24-25页 |
| 2 人瘦素蛋白制备 | 第25-43页 |
| 2.1 引言 | 第25页 |
| 2.2 实验材料与仪器 | 第25-27页 |
| 2.2.1 材料与试剂 | 第25-27页 |
| 2.2.2 主要仪器、耗材 | 第27页 |
| 2.3 实验方法 | 第27-36页 |
| 2.3.1 重组表达载体的构建 | 第27-28页 |
| 2.3.2 感受态细胞的制备 | 第28-29页 |
| 2.3.3 重组质粒的转化 | 第29-30页 |
| 2.3.4 重组表达载体序列鉴定 | 第30-31页 |
| 2.3.5 人瘦素蛋白的诱导表达 | 第31页 |
| 2.3.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第31-32页 |
| 2.3.7 重组人瘦素大肠杆菌的发酵 | 第32-33页 |
| 2.3.8 包涵体的提取、洗涤 | 第33页 |
| 2.3.9 包涵体的溶解 | 第33页 |
| 2.3.10 包涵体的复性 | 第33-34页 |
| 2.3.11 阴离子交换色谱纯化复性后蛋白 | 第34-36页 |
| 2.3.12 蛋白分子量测定 | 第36页 |
| 2.4 实验结果与讨论 | 第36-42页 |
| 2.4.1 重组表达载体的构建 | 第36页 |
| 2.4.2 人瘦素蛋白的表达 | 第36-39页 |
| 2.4.3 瘦素的可溶性检测 | 第39-40页 |
| 2.4.4 包涵体的溶解 | 第40页 |
| 2.4.5 包涵体的复性 | 第40页 |
| 2.4.6 阴离子交换色谱纯化 | 第40-41页 |
| 2.4.7 目的蛋白质谱分析结果 | 第41-42页 |
| 2.5 小结 | 第42-43页 |
| 3 抗瘦素纳米抗体的筛选 | 第43-53页 |
| 3.1 引言 | 第43页 |
| 3.2 实验材料 | 第43-45页 |
| 3.2.1 材料与试剂 | 第43-45页 |
| 3.2.2 主要仪器与耗材 | 第45页 |
| 3.3 实验方法 | 第45-49页 |
| 3.3.1 纳米抗体库的构建 | 第45页 |
| 3.3.2 噬菌体扩增 | 第45-46页 |
| 3.3.3 噬菌体滴度测定 | 第46页 |
| 3.3.4 纳米抗体的筛选 | 第46-47页 |
| 3.3.5 序列分析 | 第47-48页 |
| 3.3.6 单克隆噬菌体活性鉴定 | 第48-49页 |
| 3.4 实验结果及讨论 | 第49-52页 |
| 3.4.1 纳米抗体筛选 | 第49-50页 |
| 3.4.2 测序分析 | 第50-51页 |
| 3.4.3 Elisa活性检测 | 第51-52页 |
| 3.5 小结 | 第52-53页 |
| 4 抗瘦素纳米抗体的表达纯化 | 第53-63页 |
| 4.1 引言 | 第53页 |
| 4.2 实验材料 | 第53-54页 |
| 4.2.1 材料与试剂 | 第53-54页 |
| 4.2.2 主要仪器与耗材 | 第54页 |
| 4.3 实验方法 | 第54-57页 |
| 4.3.1 纳米抗体基因的获得及载体构建 | 第54-55页 |
| 4.3.2 纳米抗体的表达 | 第55页 |
| 4.3.3 纳米抗体可溶性表达考察 | 第55页 |
| 4.3.4 重组纳米抗体大肠杆菌的高密度发酵 | 第55-56页 |
| 4.3.5 固定化金属离子亲和色谱 | 第56页 |
| 4.3.6 测定目的蛋白浓度及纯度 | 第56-57页 |
| 4.3.7 Elisa检测纳米抗体活性 | 第57页 |
| 4.4 实验结果及讨论 | 第57-62页 |
| 4.4.1 表达载体的构建及转化 | 第57页 |
| 4.4.2 重组表达载体序列检测 | 第57-58页 |
| 4.4.3 纳米抗体的表达 | 第58页 |
| 4.4.4 重组蛋白原核表达可溶性检测 | 第58页 |
| 4.4.5 重组纳米抗体大肠杆菌的高密度发酵 | 第58-59页 |
| 4.4.6 固定化金属离子亲和色谱 | 第59-60页 |
| 4.4.7 Elisa方法检测纳米抗体活性 | 第60-62页 |
| 4.5 小结 | 第62-63页 |
| 结论 | 第63-64页 |
| 展望 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-68页 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 | 第68-69页 |
| 致谢 | 第69-70页 |