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AMPK对BMP信号通路以及异位骨化的抑制作用

摘要第3-8页
Abstract第8-14页
第一部分 引言第22-30页
    1.1 异位骨化的基本概况第22-23页
    1.2 BMP信号通路与异位骨化第23-24页
    1.3 进行性肌肉骨化症(fibrodysplasia ossificans progressive,FOP)第24-25页
    1.4 异位骨化的预防和治疗第25-26页
    1.5 AMP-激活蛋白激酶(AMPK)的基本概况第26页
    1.6 AMPK对骨代谢的调节第26-27页
    1.7 命题依据与假设第27-30页
第二部分 AMPK对FOP成纤维细胞中BMP信号通路的抑制作用第30-53页
    2.1 材料第32-36页
        2.1.1 实验细胞第32页
        2.1.2 主要试剂第32-35页
        2.1.3 主要仪器第35-36页
    2.2 方法第36-44页
        2.2.1 细胞培养第36页
        2.2.2 DNA测序FOP成纤维细胞发生ALK2突变第36页
        2.2.3 Western Blot检测第36-38页
        2.2.4 Si RNA转染第38-39页
        2.2.5 建荧光素酶互补结合实验系统(Firefly luciferase complementation asssay)第39-42页
        2.2.6 用磷酸钙沉淀法将荧光素酶质粒转染HEK293T细胞第42-43页
        2.2.7 荧光素酶活性检测第43-44页
        2.2.8 腺病毒感染细胞第44页
        2.2.9 统计学分析第44页
    2.3 结果第44-51页
        2.3.1 AMPK激活剂对FOP成纤维细胞BMP信号通路影响第44-46页
        2.3.2 AMPK抑制Smad1/5的磷酸化第46-47页
        2.3.3 AMPK对BMP信号通路关键成分Smad6、Smurf1表达以及两者相互作用的影响第47-50页
        2.3.4 Smad6和Smurf1介导二甲双胍对BMP信号通路的抑制作用第50页
        2.3.5 AMPK对ALK2蛋白酶体降解的影响第50-51页
    2.4 讨论第51-53页
第三部分 AMPK抑制来源于FOP成纤维细胞的iPS的成骨分化第53-67页
    3.1 材料第54-57页
        3.1.1 实验细胞第54页
        3.1.2 主要试剂第54-56页
        3.1.3 主要仪器第56-57页
    3.2 方法第57-61页
        3.2.1 Western Blot检测第57页
        3.2.2 碱性磷酸酶染色(ALP)检测第57页
        3.2.3 茜素红染色检测(Alizarin Red S)钙沉积物(细胞矿化)第57-58页
        3.2.4 诱导来自FOP成纤维细胞的诱导多功能干细胞(iPSs)第58-60页
        3.2.5 统计学分析第60-61页
    3.3 结果第61-64页
        3.3.1 成功诱导来源于FOP成纤维细胞的多功能干细胞第61页
        3.3.2 FOP iPS显示具有更强的成骨细胞分化能力第61-62页
        3.3.3 AMPK对FOP iPS细胞诱导的成骨细胞分化的影响第62-64页
    3.4 讨论第64-67页
第四部分 AMPK对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1细胞中BMP信号通路的抑制作用第67-77页
    4.1 材料第68-70页
        4.1.1 实验细胞第68页
        4.1.2 主要试剂第68-69页
        4.1.3 主要仪器第69-70页
    4.2 方法第70-72页
        4.2.1 Western Blot检测第70页
        4.2.2 MC3T3-E1细胞培养第70-71页
        4.2.3 转染Smad6 siRNA到MC3T3-E1细胞第71页
        4.2.4 腺病毒感染细胞第71-72页
        4.2.5 统计学分析第72页
    4.3 结果第72-75页
        4.3.1 二甲双胍对BMP信号通路关键成分Smad6、ALK2、Smurf1表达的影响第72-73页
        4.3.2 二甲双胍对BMP/Smad信号通路的影响第73页
        4.3.3 AMPK对BMP信号通路的直接效应第73-74页
        4.3.4 Smad6介导二甲双胍对BMP信号通路的作用第74-75页
    4.4 讨论第75-77页
第五部分 AMPK抑制MC3T3-E1的成骨细胞分化第77-92页
    5.1 材料第78-81页
        5.1.1 实验细胞第78页
        5.1.2 主要试剂第78-80页
        5.1.3 主要仪器第80-81页
    5.2 方法第81-84页
        5.2.1 Western Blot检测第81页
        5.2.2 碱性磷酸酶染色和活性检测第81-82页
        5.2.3 茜素红染色检测(Alizarin Red S)钙沉积物(细胞矿化)第82页
        5.2.4 MC3T3-E1细胞诱导的成骨分化第82页
        5.2.5 荧光实时定量PCR第82-84页
        5.2.6 腺病毒感染第84页
        5.2.7 统计学分析第84页
    5.3 结果第84-89页
        5.3.1 成骨分化期间AMPK活性的改变第84-85页
        5.3.2 AMPK激活剂对碱性磷酸酶活性的影响第85-86页
        5.3.3 AMPK对成骨细胞分化的直接效应第86-87页
        5.3.4 AMPK激活剂联合应用对碱性磷酸酶活性的影响第87-88页
        5.3.5 AMPK激活剂二甲双胍和阿司匹林对成骨细胞矿化的作用第88-89页
    5.4 讨论第89-92页
第六部分 二甲双胍对小鼠体内异位骨化形成的影响第92-105页
    6.1 材料第93-94页
        6.1.1 实验动物第93页
        6.1.2 主要试剂第93-94页
        6.1.3 主要仪器第94页
    6.2 方法第94-99页
        6.2.1 动物饲养第94-95页
        6.2.2 小鼠跟腱切断/烧伤法建立小鼠异位骨化模型第95-96页
        6.2.3 X线检查异位骨化第96页
        6.2.4 组织取材、固定和切片第96页
        6.2.5 组织切片HE染色第96-97页
        6.2.6 阿尔新蓝染色第97页
        6.2.7 总RNA提取、cDNA合成和qPCR第97-99页
        6.2.8 统计学分析第99页
    6.3 结果第99-103页
        6.3.1 建立创伤跟腱切断/烧伤法诱导小鼠异位骨化模型第99-100页
        6.3.2 AMPK激活剂二甲双胍对小鼠体内异位骨化形成的影响第100-103页
    6.4 讨论第103-105页
第七部分 结论与展望第105-106页
    7.1 结论第105页
    7.2 展望第105-106页
致谢第106-107页
参考文献第107-120页
攻读学位期间的研究成果第120-121页
综述第121-135页
    参考文献第129-135页

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