摘要 | 第3-8页 |
Abstract | 第8-14页 |
第一部分 引言 | 第22-30页 |
1.1 异位骨化的基本概况 | 第22-23页 |
1.2 BMP信号通路与异位骨化 | 第23-24页 |
1.3 进行性肌肉骨化症(fibrodysplasia ossificans progressive,FOP) | 第24-25页 |
1.4 异位骨化的预防和治疗 | 第25-26页 |
1.5 AMP-激活蛋白激酶(AMPK)的基本概况 | 第26页 |
1.6 AMPK对骨代谢的调节 | 第26-27页 |
1.7 命题依据与假设 | 第27-30页 |
第二部分 AMPK对FOP成纤维细胞中BMP信号通路的抑制作用 | 第30-53页 |
2.1 材料 | 第32-36页 |
2.1.1 实验细胞 | 第32页 |
2.1.2 主要试剂 | 第32-35页 |
2.1.3 主要仪器 | 第35-36页 |
2.2 方法 | 第36-44页 |
2.2.1 细胞培养 | 第36页 |
2.2.2 DNA测序FOP成纤维细胞发生ALK2突变 | 第36页 |
2.2.3 Western Blot检测 | 第36-38页 |
2.2.4 Si RNA转染 | 第38-39页 |
2.2.5 建荧光素酶互补结合实验系统(Firefly luciferase complementation asssay) | 第39-42页 |
2.2.6 用磷酸钙沉淀法将荧光素酶质粒转染HEK293T细胞 | 第42-43页 |
2.2.7 荧光素酶活性检测 | 第43-44页 |
2.2.8 腺病毒感染细胞 | 第44页 |
2.2.9 统计学分析 | 第44页 |
2.3 结果 | 第44-51页 |
2.3.1 AMPK激活剂对FOP成纤维细胞BMP信号通路影响 | 第44-46页 |
2.3.2 AMPK抑制Smad1/5的磷酸化 | 第46-47页 |
2.3.3 AMPK对BMP信号通路关键成分Smad6、Smurf1表达以及两者相互作用的影响 | 第47-50页 |
2.3.4 Smad6和Smurf1介导二甲双胍对BMP信号通路的抑制作用 | 第50页 |
2.3.5 AMPK对ALK2蛋白酶体降解的影响 | 第50-51页 |
2.4 讨论 | 第51-53页 |
第三部分 AMPK抑制来源于FOP成纤维细胞的iPS的成骨分化 | 第53-67页 |
3.1 材料 | 第54-57页 |
3.1.1 实验细胞 | 第54页 |
3.1.2 主要试剂 | 第54-56页 |
3.1.3 主要仪器 | 第56-57页 |
3.2 方法 | 第57-61页 |
3.2.1 Western Blot检测 | 第57页 |
3.2.2 碱性磷酸酶染色(ALP)检测 | 第57页 |
3.2.3 茜素红染色检测(Alizarin Red S)钙沉积物(细胞矿化) | 第57-58页 |
3.2.4 诱导来自FOP成纤维细胞的诱导多功能干细胞(iPSs) | 第58-60页 |
3.2.5 统计学分析 | 第60-61页 |
3.3 结果 | 第61-64页 |
3.3.1 成功诱导来源于FOP成纤维细胞的多功能干细胞 | 第61页 |
3.3.2 FOP iPS显示具有更强的成骨细胞分化能力 | 第61-62页 |
3.3.3 AMPK对FOP iPS细胞诱导的成骨细胞分化的影响 | 第62-64页 |
3.4 讨论 | 第64-67页 |
第四部分 AMPK对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1细胞中BMP信号通路的抑制作用 | 第67-77页 |
4.1 材料 | 第68-70页 |
4.1.1 实验细胞 | 第68页 |
4.1.2 主要试剂 | 第68-69页 |
4.1.3 主要仪器 | 第69-70页 |
4.2 方法 | 第70-72页 |
4.2.1 Western Blot检测 | 第70页 |
4.2.2 MC3T3-E1细胞培养 | 第70-71页 |
4.2.3 转染Smad6 siRNA到MC3T3-E1细胞 | 第71页 |
4.2.4 腺病毒感染细胞 | 第71-72页 |
4.2.5 统计学分析 | 第72页 |
4.3 结果 | 第72-75页 |
4.3.1 二甲双胍对BMP信号通路关键成分Smad6、ALK2、Smurf1表达的影响 | 第72-73页 |
4.3.2 二甲双胍对BMP/Smad信号通路的影响 | 第73页 |
4.3.3 AMPK对BMP信号通路的直接效应 | 第73-74页 |
4.3.4 Smad6介导二甲双胍对BMP信号通路的作用 | 第74-75页 |
4.4 讨论 | 第75-77页 |
第五部分 AMPK抑制MC3T3-E1的成骨细胞分化 | 第77-92页 |
5.1 材料 | 第78-81页 |
5.1.1 实验细胞 | 第78页 |
5.1.2 主要试剂 | 第78-80页 |
5.1.3 主要仪器 | 第80-81页 |
5.2 方法 | 第81-84页 |
5.2.1 Western Blot检测 | 第81页 |
5.2.2 碱性磷酸酶染色和活性检测 | 第81-82页 |
5.2.3 茜素红染色检测(Alizarin Red S)钙沉积物(细胞矿化) | 第82页 |
5.2.4 MC3T3-E1细胞诱导的成骨分化 | 第82页 |
5.2.5 荧光实时定量PCR | 第82-84页 |
5.2.6 腺病毒感染 | 第84页 |
5.2.7 统计学分析 | 第84页 |
5.3 结果 | 第84-89页 |
5.3.1 成骨分化期间AMPK活性的改变 | 第84-85页 |
5.3.2 AMPK激活剂对碱性磷酸酶活性的影响 | 第85-86页 |
5.3.3 AMPK对成骨细胞分化的直接效应 | 第86-87页 |
5.3.4 AMPK激活剂联合应用对碱性磷酸酶活性的影响 | 第87-88页 |
5.3.5 AMPK激活剂二甲双胍和阿司匹林对成骨细胞矿化的作用 | 第88-89页 |
5.4 讨论 | 第89-92页 |
第六部分 二甲双胍对小鼠体内异位骨化形成的影响 | 第92-105页 |
6.1 材料 | 第93-94页 |
6.1.1 实验动物 | 第93页 |
6.1.2 主要试剂 | 第93-94页 |
6.1.3 主要仪器 | 第94页 |
6.2 方法 | 第94-99页 |
6.2.1 动物饲养 | 第94-95页 |
6.2.2 小鼠跟腱切断/烧伤法建立小鼠异位骨化模型 | 第95-96页 |
6.2.3 X线检查异位骨化 | 第96页 |
6.2.4 组织取材、固定和切片 | 第96页 |
6.2.5 组织切片HE染色 | 第96-97页 |
6.2.6 阿尔新蓝染色 | 第97页 |
6.2.7 总RNA提取、cDNA合成和qPCR | 第97-99页 |
6.2.8 统计学分析 | 第99页 |
6.3 结果 | 第99-103页 |
6.3.1 建立创伤跟腱切断/烧伤法诱导小鼠异位骨化模型 | 第99-100页 |
6.3.2 AMPK激活剂二甲双胍对小鼠体内异位骨化形成的影响 | 第100-103页 |
6.4 讨论 | 第103-105页 |
第七部分 结论与展望 | 第105-106页 |
7.1 结论 | 第105页 |
7.2 展望 | 第105-106页 |
致谢 | 第106-107页 |
参考文献 | 第107-120页 |
攻读学位期间的研究成果 | 第120-121页 |
综述 | 第121-135页 |
参考文献 | 第129-135页 |