| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第一章 文献综述 | 第10-22页 |
| 1.1 微生物的脂肪酶 | 第10-13页 |
| 1.1.1 微生物脂肪酶的类型 | 第10页 |
| 1.1.2 微生物脂肪酶的生产及应用 | 第10-13页 |
| 1.2 枯草芽孢杆菌的脂肪酶 | 第13-14页 |
| 1.2.1 枯草芽孢杆菌脂肪酶的特性 | 第13-14页 |
| 1.2.2 枯草芽孢杆菌脂肪酶基因 | 第14页 |
| 1.3 枯草芽孢杆菌的Sec分泌途径 | 第14-17页 |
| 1.3.1 Sec分泌途径的组成 | 第15页 |
| 1.3.2 Sec分泌途径的信号肽 | 第15-16页 |
| 1.3.3 Sec分泌途径的分泌机制 | 第16-17页 |
| 1.4 枯草芽孢杆菌的Tat分泌途径 | 第17-19页 |
| 1.4.1 Tat分泌途径的组成 | 第17-18页 |
| 1.4.2 Tat转位酶基因 | 第18页 |
| 1.4.3 Tat分泌途径的信号肽及分泌组 | 第18-19页 |
| 1.4.4 Tat分泌途径的分泌机制 | 第19页 |
| 1.5 枯草芽孢杆菌脂肪酶发酵菌株的遗传育种 | 第19-21页 |
| 1.6 本文的研究目的和意义 | 第21-22页 |
| 第二章 材料与方法 | 第22-40页 |
| 2.1 实验材料 | 第22-31页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第22-24页 |
| 2.1.2 PCR引物 | 第24-26页 |
| 2.1.3 主要药品 | 第26-28页 |
| 2.1.4 主要试剂 | 第28-29页 |
| 2.1.5 培养基 | 第29-30页 |
| 2.1.6 主要仪器 | 第30-31页 |
| 2.2 实验方法 | 第31-40页 |
| 2.2.1 枯草芽孢杆菌染色体DNA的提取 | 第31页 |
| 2.2.2 质粒的提取-CTAB法 | 第31-32页 |
| 2.2.3 PCR扩增 | 第32-33页 |
| 2.2.4 重叠PCR拼接 | 第33-34页 |
| 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳 | 第34页 |
| 2.2.6 枯草芽孢杆菌感受态细胞转化 | 第34页 |
| 2.2.7 无标记基因敲除法 | 第34-35页 |
| 2.2.8 菌种的保藏 | 第35页 |
| 2.2.9 细菌总RNA的提取 | 第35-36页 |
| 2.2.10 cDNA的合成 | 第36页 |
| 2.2.11 荧光定量PCR | 第36-37页 |
| 2.2.12 摇瓶发酵培养 | 第37页 |
| 2.2.13 对硝基苯酚工作曲线的绘制 | 第37-38页 |
| 2.2.14 脂肪酶酶活的测定 | 第38页 |
| 2.2.15 聚丙烯凝胶电泳 | 第38-40页 |
| 第三章 结果与分析 | 第40-67页 |
| 3.1 脂肪酶发酵适宜宿主菌的筛选 | 第40-41页 |
| 3.1.1 B. subtillis 168/pHP13L菌株的构建 | 第40-41页 |
| 3.1.2 B. subtillis 168 和DB104脂肪酶发酵的比较 | 第41页 |
| 3.2 B. subtillis 168 胞外蛋白酶缺失对脂肪酶发酵的影响 | 第41-48页 |
| 3.2.1 中性蛋白酶基因nprE的敲除 | 第41-44页 |
| 3.2.2 碱性蛋白酶基因aprE的敲除 | 第44-46页 |
| 3.2.3 NprE和AprE缺失对脂肪酶发酵的影响 | 第46-48页 |
| 3.3 Sec途径依赖型胞外蛋白缺失菌株的构建 | 第48-58页 |
| 3.3.1 yolA-yolB操纵子的敲除 | 第48-51页 |
| 3.3.2 xynA基因的敲除 | 第51-54页 |
| 3.3.3 yncM基因的敲除 | 第54-56页 |
| 3.3.4 csn基因的敲除 | 第56-58页 |
| 3.4 依赖Sec途径的胞外蛋白缺失对脂肪酶发酵的影响 | 第58-60页 |
| 3.4.1 质粒pHP13L的转化及转化子的验证 | 第58页 |
| 3.4.2 胞外蛋白缺失菌株的脂肪酶发酵 | 第58-60页 |
| 3.5 过表达TatAdCd转位酶对脂肪酶发酵的影响 | 第60-67页 |
| 3.5.1 tat AD-CD操纵子的过表达 | 第60-63页 |
| 3.5.2 过表达tat AD-CD操纵子的转录分析 | 第63-64页 |
| 3.5.3 脂肪酶表达质粒的转化及转化子的验证 | 第64页 |
| 3.5.4 tatAD-CD操纵子过表达菌株的脂肪酶发酵 | 第64-65页 |
| 3.5.5 发酵液的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 | 第65-67页 |
| 第四章 结论与展望 | 第67-69页 |
| 4.1 主要结论 | 第67页 |
| 4.2 创新点 | 第67-68页 |
| 4.3 展望 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-76页 |
| 发表论文和参加科研情况说明 | 第76-77页 |
| 致谢 | 第77-78页 |
