| 中文摘要 | 第1-14页 |
| Abstract | 第14-17页 |
| 1. 前言 | 第17-41页 |
| ·纤维素的概况 | 第18-21页 |
| ·纤维素的组成 | 第18-19页 |
| ·纤维素的降解 | 第19-21页 |
| ·纤维素酶的研究进展 | 第21-34页 |
| ·纤维素酶的研究过程 | 第21-22页 |
| ·纤维素酶的分类 | 第22-23页 |
| ·纤维素酶的结构与功能 | 第23-28页 |
| ·纤维素酶的作用机理 | 第28-31页 |
| ·纤维素酶的应用 | 第31-34页 |
| ·嗜热真菌的研究进展 | 第34-38页 |
| ·嗜热真菌的定义及分类情况 | 第34-36页 |
| ·嗜热真菌的分子生物学情况 | 第36页 |
| ·嗜热真菌的经济学意义 | 第36-38页 |
| ·选题的目的意义、研究内容、技术路线 | 第38-41页 |
| ·选题的目的意义 | 第38-39页 |
| ·研究内容 | 第39-40页 |
| ·技术路线 | 第40-41页 |
| 2. 材料与方法 | 第41-70页 |
| ·材料 | 第41-46页 |
| ·供试菌株 | 第41页 |
| ·酶和生化试剂 | 第41-42页 |
| ·仪器 | 第42页 |
| ·处理软件 | 第42-43页 |
| ·RNA-seq数据分析所用到的软件 | 第42-43页 |
| ·核酸及蛋白序列分析软件 | 第43页 |
| ·溶液配制 | 第43-46页 |
| ·培养基的配置 | 第46页 |
| ·嗜热毁丝菌RNA-seq测序 | 第46-49页 |
| ·样品的制备 | 第46-47页 |
| ·RNA-seq测序 | 第47-49页 |
| ·Total RNA样品检测 | 第47页 |
| ·文库构建及库检 | 第47-48页 |
| ·上机测序 | 第48页 |
| ·生物信息学分析 | 第48-49页 |
| ·目的基因的筛选及验证 | 第49页 |
| ·cel1和cel2基因的克隆及序列分析 | 第49-55页 |
| ·基因的扩增 | 第49-51页 |
| ·PCR产物回收及载体连接 | 第51-52页 |
| ·大肠杆菌感受态的转化 | 第52-53页 |
| ·重组质粒的DNA检测及提取 | 第53-55页 |
| ·cel1和cel2基因在毕赤酵母中的高效表达 | 第55-62页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第55-57页 |
| ·重组质粒线性化 | 第57-58页 |
| ·毕赤酵母感受态细胞的制备 | 第58-59页 |
| ·重组质粒电击转化酵母感受态细胞 | 第59-60页 |
| ·酵母转化子的筛选及鉴定 | 第60-61页 |
| ·Cel1和Cel2的诱导分泌表达 | 第61-62页 |
| ·重组酶Cel1及Cel2的纯化 | 第62-64页 |
| ·硫酸铵沉淀及透析 | 第62页 |
| ·His TrapT M FF柱层析 | 第62页 |
| ·纯化蛋白含量测定 | 第62-63页 |
| ·纯化蛋白的SDS-PAGE分析 | 第63-64页 |
| ·对Cel1及Cel2进行位点突变及蛋白表达 | 第64页 |
| ·Cel1和Cel2的酶学特性研究 | 第64-70页 |
| ·Cel1和Cel2水解酶活性测定 | 第64页 |
| ·Cel1和Cel2蛋白去糖化 | 第64-65页 |
| ·最适反应p H | 第65页 |
| ·最适反应温度 | 第65-66页 |
| ·温度稳定性 | 第66页 |
| ·Tm测定 | 第66页 |
| ·米氏常数的测定 | 第66-67页 |
| ·底物特异性分析 | 第67页 |
| ·水解产物鉴定 | 第67-68页 |
| ·突变重组酶的水解活性测定 | 第68-70页 |
| 3. 结果与分析 | 第70-121页 |
| ·RNA-seq测序结果分析及检验 | 第70-83页 |
| ·测序结果 | 第70-80页 |
| ·测序数据的序列统计 | 第70-73页 |
| ·样品mapping率 | 第73页 |
| ·RNA-seq整体质量评估 | 第73-75页 |
| ·样品间相关性检查 | 第75-77页 |
| ·样品间差异表达分析 | 第77页 |
| ·样品间差异基因的筛选 | 第77-78页 |
| ·差异基因数目 | 第78-79页 |
| ·差异基因表达水平聚类分析 | 第79-80页 |
| ·差异表达基因GO富集分析 | 第80页 |
| ·目的基因cel1与cel2的筛选 | 第80-81页 |
| ·cel1与cel2基因表达情况验证 | 第81-83页 |
| ·ce1l与cel2的序列分析 | 第83-96页 |
| ·ce1l与cel2基因核苷酸序列分析 | 第83-84页 |
| ·cel1核苷酸序列分析 | 第83-84页 |
| ·cel2核苷酸序列分析 | 第84页 |
| ·Cel1与Cel2氨基酸序列分析 | 第84-96页 |
| ·Cel1与Cel2蛋白一级结构分析 | 第84-88页 |
| ·Cel1与Cel2蛋白二级结构分析 | 第88-96页 |
| ·cel1与cel2基因在毕赤酵母中的高效表达 | 第96-107页 |
| ·限制性内切酶的位点分析 | 第96-97页 |
| ·成熟肽序列的扩增 | 第97-99页 |
| ·酵母表达载体的构建和鉴定 | 第99-101页 |
| ·重组表达质粒转化毕赤酵母及转化子的筛选鉴定 | 第101-103页 |
| ·重组表达质粒的转化 | 第101页 |
| ·重组表达质粒转化子的筛选 | 第101-103页 |
| ·酵母中诱导分泌表达及表达产物的检测 | 第103-107页 |
| ·工程菌株的鉴定 | 第103-104页 |
| ·工程菌株甲醇诱导表达及蛋白纯化 | 第104-106页 |
| ·表达产物质谱鉴定 | 第106-107页 |
| ·酶学性质研究 | 第107-121页 |
| ·酶谱检测 | 第107-108页 |
| ·蛋白去糖化检测 | 第108-109页 |
| ·酶法去糖基化 | 第108页 |
| ·TMSF法去糖基化 | 第108-109页 |
| ·最适反应p H | 第109-110页 |
| ·最适反应温度 | 第110-111页 |
| ·热稳定性 | 第111页 |
| ·Tm测定 | 第111-112页 |
| ·底物特异性测定 | 第112-113页 |
| ·米氏常数的测定 | 第113页 |
| ·水解产物测定 | 第113-118页 |
| ·Cel1和Cel2水解多糖底物后产物的TLC测定 | 第113-114页 |
| ·Cel1和Cel2水解多糖底物后产物的HPAEC-PAD测定 | 第114-115页 |
| ·Cel1和Cel2水解寡糖后产物的TLC测定 | 第115-118页 |
| ·突变基因表达产物测定 | 第118-121页 |
| ·突变基因转化子的筛选 | 第118-119页 |
| ·突变蛋白的酶谱测定 | 第119-120页 |
| ·突变蛋白的酶活测定 | 第120-121页 |
| 4. 讨论 | 第121-125页 |
| ·cel1和cel2基因克隆及序列分析 | 第121页 |
| ·Cel1和Cel2水解酶活性研究 | 第121-122页 |
| ·热稳定性的研究 | 第122-123页 |
| ·涉及水解活性的关键位点的研究 | 第123-125页 |
| 5. 结论 | 第125-128页 |
| ·cel1和cel2基因的筛选 | 第125页 |
| ·cel1和cel2基因表达情况验证 | 第125页 |
| ·序列分析 | 第125-126页 |
| ·cel1和cel2基因的异源表达 | 第126页 |
| ·Cel1和Cel2水解酶活性测定 | 第126页 |
| ·Cel1和Cel2的热稳定性 | 第126页 |
| ·Cel1和Cel2水解产物的测定 | 第126-127页 |
| ·突变酶测定 | 第127-128页 |
| 参考文献 | 第128-134页 |
| 致谢 | 第134-135页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第135页 |