| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-21页 |
| 引言 | 第11-12页 |
| ·生物学特性及应用 | 第12-17页 |
| ·食品质量检测 | 第13页 |
| ·精神疾病及癌症的治疗 | 第13-14页 |
| ·纯化消旋混合物及新药开发 | 第14-15页 |
| ·两步酶法生产7-aminocephalosporanic acid(7-ACA) | 第15-16页 |
| ·生物传感器 | 第16-17页 |
| ·D-氨基酸氧化酶表达条件的优化 | 第17-18页 |
| ·培养条件的筛选与优化 | 第17页 |
| ·改变细胞通透性的研究 | 第17-18页 |
| ·D-氨基酸氧化酶的定点突变及酶学特性研究 | 第18-21页 |
| ·纤细红酵母RgDAAO定点突变及底物特异性研究 | 第18-19页 |
| ·三角酵母TvDAAO定点诱变改变底物特异性的研究 | 第19-21页 |
| 第二章 原玻璃蝇节杆菌D-氨基酸氧化酶基因的表达及纯化 | 第21-35页 |
| 前言 | 第21-22页 |
| ·材料与方法 | 第22-28页 |
| ·菌种与质粒 | 第22页 |
| ·培养基 | 第22页 |
| ·溶液 | 第22页 |
| ·酶和生化试剂 | 第22-23页 |
| ·DNA操作 | 第23-25页 |
| ·总DNA的提取 | 第23页 |
| ·DNA浓度和纯度的测定 | 第23-24页 |
| ·质粒DNA的提取和纯化 | 第24页 |
| ·试剂盒提取质粒DNA | 第24页 |
| ·酒精沉淀法纯化DNA | 第24-25页 |
| ·DNA酶切、回收、转化等 | 第25页 |
| ·实验所用引物 | 第25页 |
| ·D-氨基酸氧化酶基因克隆 | 第25-26页 |
| ·序列测定和分析 | 第26页 |
| ·D-氨基酸氧化酶活性分析 | 第26-27页 |
| ·D-氨基酸氧化酶的表达与纯化 | 第27-28页 |
| ·D-氨基酸氧化酶的诱导培养 | 第27页 |
| ·Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白 | 第27-28页 |
| ·蛋白纯度鉴定和浓度测定 | 第28页 |
| ·结果与分析 | 第28-34页 |
| ·Apdaao基因的PCR扩增结果及pETApdaao双酶切验证结果 | 第28-30页 |
| ·Apdaao基因序列测序结果及比对结果 | 第30-33页 |
| ·DAAO纯化结果 | 第33-34页 |
| ·小结 | 第34-35页 |
| 第三章 D-氨基酸氧化酶基因的定点突变 | 第35-55页 |
| 前言 | 第35-36页 |
| ·材料和方法 | 第36-42页 |
| ·工具酶和试剂 | 第36页 |
| ·DNA聚合酶及增强剂 | 第36页 |
| ·限制性内切酶及消化酶 | 第36页 |
| ·试剂盒 | 第36页 |
| ·定点突变引物设计 | 第36-37页 |
| ·重叠延伸法定点突变 | 第37-39页 |
| ·退火温度的测定 | 第37-38页 |
| ·目的片段的克隆 | 第38-39页 |
| ·目的片段与克隆载体的连接及验证 | 第39页 |
| ·目的基因的表达 | 第39页 |
| ·试剂盒法(一步法)定点突变 | 第39-42页 |
| ·结果与分析 | 第42-54页 |
| ·重叠法构建T286A突变体 | 第42-45页 |
| ·T286A的PCR结果 | 第42-44页 |
| ·T286A的测序及比对结果 | 第44-45页 |
| ·一步法构建E115A、N119D、T256K突变体 | 第45-53页 |
| ·E115A、N119D、T256K的PCR扩增结果及酶切验证结果 | 第45-47页 |
| ·测序及比对结果 | 第47-53页 |
| ·突变体酶蛋白纯化结果 | 第53-54页 |
| ·小结 | 第54-55页 |
| 第四章 D-氨基酸氧化酶的酶学特性研究 | 第55-64页 |
| 前言 | 第55-56页 |
| ·材料与方法 | 第56-58页 |
| ·本研究所用D-氨基酸氧化酶 | 第56-57页 |
| ·培养条件 | 第56页 |
| ·菌体收集破碎及酶的纯化 | 第56页 |
| ·蛋白纯度鉴定和浓度测定 | 第56-57页 |
| ·实验方法 | 第57-58页 |
| ·底物特异性实验 | 第57页 |
| ·反应最适pH值 | 第57页 |
| ·反应最适温度 | 第57页 |
| ·pH稳定性 | 第57-58页 |
| ·实验结果与分析 | 第58-63页 |
| ·底物特异性 | 第58-59页 |
| ·最适反应温度 | 第59-60页 |
| ·最适反应pH | 第60-62页 |
| ·pH稳定性 | 第62-63页 |
| ·小结 | 第63-64页 |
| 第五章 实验结果及展望 | 第64-68页 |
| ·实验结果汇总 | 第64-66页 |
| ·野生型D-氨基酸氧化酶基因的表达及纯化 | 第64页 |
| ·野生型D-氨基酸氧化酶基因的克隆及载体构建 | 第64页 |
| ·野生型D-氨基酸氧化酶的表达纯化 | 第64页 |
| ·突变体D-氨基酸氧化酶基因的表达及纯化 | 第64-65页 |
| ·突变体D-氨基酸氧化酶基因的获得 | 第64-65页 |
| ·突变体D-氨基酸氧化酶的表达纯化 | 第65页 |
| ·D-氨基酸氧化酶的基本酶学特性分析 | 第65-66页 |
| ·底物特异性研究 | 第65页 |
| ·反应最适温度 | 第65-66页 |
| ·反应最适pH值 | 第66页 |
| ·反应pH值稳定性 | 第66页 |
| ·总结与展望 | 第66-68页 |
| 参考文献 | 第68-72页 |
| 致谢 | 第72-73页 |
| 附录A | 第73-74页 |
| 附录B | 第74页 |
