| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-10页 |
| 第1章 引言 | 第10-20页 |
| ·辅因子再生 | 第10-11页 |
| ·甲酸脱氢酶(FDH) | 第11-14页 |
| ·甲酸脱氢酶的概念 | 第11-12页 |
| ·甲酸脱氢酶的来源和氨基酸序列 | 第12-13页 |
| ·NAD+依赖型甲酸脱氢酶的理化性质 | 第13页 |
| ·甲酸脱氢酶在辅酶再生系统的应用 | 第13-14页 |
| ·甲酸脱氢酶的蛋白质工程改造 | 第14-18页 |
| ·FDH蛋白质工程改造的方法 | 第15-16页 |
| ·结构分析 | 第15页 |
| ·氨基酸序列比对 | 第15-16页 |
| ·FDH蛋白质工程改造实例 | 第16-18页 |
| ·改变底物专一性 | 第16-17页 |
| ·改变FDH的催化活力 | 第17页 |
| ·改进FDH的操作稳定性 | 第17页 |
| ·FDH热稳定性的提高 | 第17-18页 |
| ·改变FDH的辅酶专一性 | 第18页 |
| ·甲酸脱氢酶于工业应用及辅酶再生系统的展望 | 第18-19页 |
| ·本论文的目的和意义 | 第19-20页 |
| 第2章 酿酒酵母甲酸脱氢酶在大肠杆菌中的高表达,纯化及酶学性质研究. | 第20-41页 |
| ·引言 | 第20页 |
| ·材料与方法 | 第20-27页 |
| ·实验材料 | 第20-23页 |
| ·主要试剂 | 第20页 |
| ·菌株及质粒 | 第20-21页 |
| ·培养基及培养条件 | 第21页 |
| ·缓冲液 | 第21-23页 |
| ·实验方法 | 第23-27页 |
| ·菌种保藏 | 第23页 |
| ·破除酵母细胞壁法抽提酵母基因组DNA(简称菌液法) | 第23页 |
| ·CTAB法抽提基因组DNA | 第23-24页 |
| ·基因组DNA纯化试剂盒 | 第24页 |
| ·DNA的琼脂糖凝胶电泳 | 第24页 |
| ·DNA的凝胶回收-试剂盒回收法 | 第24页 |
| ·目的片断与载体连接 | 第24页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第24页 |
| ·转化 | 第24-25页 |
| ·质粒的抽提 | 第25页 |
| ·表达质粒构建及SceFDH的表达 | 第25-26页 |
| ·重组酶的纯化 | 第26页 |
| ·甲酸脱氢酶酶活的测定和酶学性质研究 | 第26-27页 |
| ·酶的最适反应pH | 第27页 |
| ·酶的pH值稳定性 | 第27页 |
| ·酶的最适反应温度 | 第27页 |
| ·酶的热稳定性 | 第27页 |
| ·酶的Km值的测定 | 第27页 |
| ·结果与分析 | 第27-40页 |
| ·酵母基因组DNA的抽提 | 第27-30页 |
| ·酵母基因组DNA抽提方法的选择 | 第27-28页 |
| ·CTAB法分别抽提酿酒酵母和毕赤酵母基因组DNA | 第28-30页 |
| ·fdh基因的扩增及克隆 | 第30-33页 |
| ·Overlap PCR校正fdh中的突变位点 | 第33-35页 |
| ·构建表达质粒pET28a-fdh | 第35页 |
| ·甲酸脱氢酶基因fdh在大肠杆菌中的高效表达及优化 | 第35-37页 |
| ·重组SceFDH的分离纯化 | 第37-38页 |
| ·重组SceFDH的酶学性质研究 | 第38-40页 |
| ·酶的最适反应pH | 第38页 |
| ·酶的pH稳定性 | 第38-39页 |
| ·酶的最适反应温度 | 第39页 |
| ·酶的热稳定性 | 第39-40页 |
| ·酶的Km值的测定 | 第40页 |
| ·本章小结 | 第40-41页 |
| 第3章 通过定点突变改变酿酒酵母甲酸脱氢酶的辅因子专一性 | 第41-59页 |
| ·引言 | 第41-42页 |
| ·材料与方法 | 第42-46页 |
| ·实验材料 | 第42页 |
| ·主要试剂 | 第42页 |
| ·菌株及质粒 | 第42页 |
| ·培养基及培养条件 | 第42页 |
| ·实验方法 | 第42-46页 |
| ·定点突变 | 第42-45页 |
| ·突变体库fdh基因的表达 | 第45页 |
| ·突变体库的筛选 | 第45页 |
| ·甲酸脱氢酶突变体酶活的测定 | 第45-46页 |
| ·甲酸脱氢酶突变体酶学性质的研究 | 第46页 |
| ·酶的最适反应pH | 第46页 |
| ·酶的pH稳定性 | 第46页 |
| ·酶的最适反应温度 | 第46页 |
| ·酶的热稳定性 | 第46页 |
| ·酶的动力学研究 | 第46页 |
| ·结果与分析 | 第46-57页 |
| ·突变位点的选择 | 第46-49页 |
| ·第一轮定点突变 | 第49-50页 |
| ·第二轮定点饱和突变 | 第50-52页 |
| ·筛选方法的建立 | 第50-51页 |
| ·突变体库的筛选 | 第51-52页 |
| ·突变体阳性克隆的测序、表达与活性测定 | 第52-53页 |
| ·突变体SceFDH的分离纯化 | 第53-54页 |
| ·突变体酶学性质研究 | 第54-57页 |
| ·酶的最适反应pH | 第54-55页 |
| ·酶的pH稳定性 | 第55-56页 |
| ·酶的最适反应温度 | 第56页 |
| ·酶的热稳定性 | 第56-57页 |
| ·酶的动力学研究 | 第57页 |
| ·本章小结 | 第57-59页 |
| 第4章 总结与展望 | 第59-61页 |
| ·全文总结 | 第59-60页 |
| ·展望 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-64页 |
| 致谢 | 第64页 |
