| 中文摘要 | 第1-7页 |
| 英文摘要 | 第7-14页 |
| 文献综述 | 第14-55页 |
| 第一章 猪瘟及猪瘟病毒的研究进展 | 第14-39页 |
| ·猪瘟的研究进展 | 第14-19页 |
| ·猪瘟概述 | 第14-15页 |
| ·猪瘟的流行病学和临床症状 | 第15-17页 |
| ·猪瘟病毒的细胞培养 | 第17页 |
| ·CSFV 的侵入及其在体内的增殖 | 第17-18页 |
| ·猪瘟的诊断和防制 | 第18-19页 |
| ·猪瘟病毒的形态及理化特性 | 第19-20页 |
| ·CSFV 的分子生物学研究进展 | 第20-29页 |
| ·CSFV 的基因组结构 | 第20-21页 |
| ·CSFV 基因组全序列研究概述 | 第21-22页 |
| ·CSFV 的5′-NCR 和3′-NCR 结构 | 第22-24页 |
| ·CSFV 多聚蛋白的翻译与加工 | 第24-26页 |
| ·CSFV 基因组编码的蛋白质及其功能 | 第26-29页 |
| ·CSFV 的分子免疫学研究进展 | 第29-32页 |
| ·猪瘟病毒的致病机理 | 第32-39页 |
| ·猪瘟病毒与宿主细胞的相互作用 | 第32-33页 |
| ·致细胞病变型CSFV | 第33-36页 |
| ·NS3 基因在病毒的复制及病毒与宿主细胞关系中的作用 | 第36-39页 |
| 第二章 差异显示技术及血管内皮细胞的体外培养研究进展 | 第39-50页 |
| ·基因表达研究方法 | 第39-41页 |
| ·Northern 杂交法 | 第39页 |
| ·S1 核酸酶保护法 | 第39页 |
| ·差减杂交技术 | 第39-41页 |
| ·差异显示法 | 第41页 |
| ·差异显示逆转录PCR 法 | 第41-45页 |
| ·DDRT-PCR 方法的基本原理 | 第41页 |
| ·DDRT-PCR 的引物设计 | 第41-43页 |
| ·DDRT-PCR 的的使用策略 | 第43-45页 |
| ·实验材料的选择 | 第43页 |
| ·RNA 的提取 | 第43页 |
| ·DDRT-PCR 的逆转录 | 第43页 |
| ·DDRT-PCR 的PCR | 第43-44页 |
| ·差异条带的回收和再扩增 | 第44-45页 |
| ·差异片段的筛选鉴定、克隆、顺序 | 第45页 |
| ·全基因序列的获得 | 第45页 |
| ·DDRT-PCR 的展望 | 第45页 |
| ·血管内皮细胞培养的发展简况 | 第45-50页 |
| ·血管内皮细胞体外培养的应用 | 第46-47页 |
| ·血管内皮细胞的结构 | 第46-47页 |
| ·血管内皮细胞的功能 | 第47页 |
| ·血管内皮细胞培养的特性 | 第47-48页 |
| ·体外培养内皮细胞的来源 | 第47-48页 |
| ·体外培养内皮细胞的形态结构 | 第48页 |
| ·体外培养内皮细胞的条件 | 第48-50页 |
| ·常用的合成培养基 | 第48-49页 |
| ·血清 | 第49页 |
| ·促生长因子 | 第49-50页 |
| 第三章 猪瘟基因工程疫苗的研究进展 | 第50-55页 |
| ·猪瘟传统疫苗研究 | 第50页 |
| ·猪瘟基因工程疫苗研究的意义 | 第50-51页 |
| ·猪瘟基因工程疫苗研究的进展 | 第51-55页 |
| 试验研究 | 第55-127页 |
| 第四章 猪瘟Shimen 株对猪血管内皮细胞的致病变作用 | 第55-86页 |
| ·材料 | 第56-58页 |
| ·细胞培养用材料和毒株 | 第56页 |
| ·细胞培养基 | 第56页 |
| ·细胞培养用溶液 | 第56-57页 |
| ·检测用试剂 | 第57-58页 |
| ·主要仪器设备 | 第58页 |
| ·引物的设计与合成 | 第58页 |
| ·方法 | 第58-63页 |
| ·猪脐静脉血管内皮细胞的分离培养及鉴定 | 第58-60页 |
| ·培养液的准备 | 第58页 |
| ·猪脐静脉血管内皮细胞的分离 | 第58-59页 |
| ·脐静脉血管内皮细胞的原代培养 | 第59页 |
| ·血管内皮细胞的传代培养 | 第59页 |
| ·血管内皮细胞的纯化 | 第59页 |
| ·血管内皮细胞生长曲线的测定 | 第59页 |
| ·血管内皮细胞的鉴定 | 第59-60页 |
| ·猪瘟Shimen 株致猪血管血管内皮细胞和PK-15 细胞 | 第60页 |
| ·猪脐静脉血管内皮细胞的分离培养及鉴定和PK-15 细胞复苏 | 第60页 |
| ·病毒材料的准备 | 第60页 |
| ·猪瘟病毒Shimen 猪和C-株接种猪血管内皮细胞 | 第60页 |
| ·猪瘟病毒Shimen 猪和C-株接种猪血管内皮细胞后的观察 | 第60页 |
| ·猪瘟Shimen 株和C-株接种猪血管内皮细胞的电镜观察 | 第60页 |
| ·猪瘟Shimen 株和C-株接种猪血管内皮细胞和PK-15 细胞后的检测 | 第60-61页 |
| ·猪瘟Shimen 株和C-株接种PK-15 细胞后的荧光检测 | 第60页 |
| ·猪瘟Shimen 株接种猪血管内皮细胞后的PCR 检测 | 第60-61页 |
| ·猪瘟Shimen 株致猪血管内皮细胞病变后E2 和P80 基因的检测 | 第61-62页 |
| ·毒株 | 第61页 |
| ·病毒RNA 提取 | 第61页 |
| ·RT-PCR 和nPCR | 第61页 |
| ·扩增产物的纯化 | 第61页 |
| ·扩增产物的连接转化 | 第61-62页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第62页 |
| ·核酸序列测定及分析 | 第62页 |
| ·猪瘟Shimen 株致猪血管内皮细胞病变后DI 颗粒的检测 | 第62-63页 |
| ·样品RNA | 第62页 |
| ·提取的样品总RNA 的鉴定 | 第62页 |
| ·探针标记 | 第62页 |
| ·探针浓度的确定 | 第62页 |
| ·杂交 | 第62页 |
| ·BCIP/NBT 显色法检测 | 第62-63页 |
| ·结果 | 第63-81页 |
| ·细胞形态和特征 | 第63-64页 |
| ·细胞生长曲线 | 第64页 |
| ·猪血管内皮细胞的鉴定结果 | 第64-65页 |
| ·第八因子(F-ⅧR)Ag 的检测 | 第64页 |
| ·扫描电镜观察 | 第64-65页 |
| ·猪瘟Shimen 株感染猪血管内皮细胞的形态特征 | 第65-66页 |
| ·猪瘟C-株感染猪血管内皮细胞的形态特征 | 第66-67页 |
| ·猪瘟Shimen 株和C-株感染PK-15 细胞的形态特征 | 第67页 |
| ·猪瘟Shimen 株和C-株感染猪血管内皮细胞的透射电镜观察 | 第67-68页 |
| ·猪瘟Shimen 株和C-株接种PK-15 细胞后的荧光检测 | 第68-69页 |
| ·猪瘟Shimen 株接种猪血管内皮细胞后PCR 检测 | 第69页 |
| ·猪瘟Shimen 株致猪血管内皮细胞病变后E2 基因的序列分析 | 第69-73页 |
| ·PCR 扩增结果 | 第69-70页 |
| ·质粒PCR 及酶切鉴定结果 | 第70页 |
| ·E2 基因的序列分析 | 第70-73页 |
| ·猪瘟Shimen 株致猪血管内皮细胞病变后P80 基因的序列分析 | 第73-80页 |
| ·PCR 扩增结果 | 第73-74页 |
| ·质粒PCR 及酶切鉴定结果 | 第74页 |
| ·P80 基因的序列分析 | 第74-80页 |
| ·猪瘟Shimen 株致猪血管内皮细胞病变后DI 颗粒的检测 | 第80页 |
| ·甲醛变性凝胶电泳 | 第80页 |
| ·杂交探针的浓度测定 | 第80页 |
| ·Northern 杂交结果 | 第80-81页 |
| ·讨论 | 第81-84页 |
| ·小结 | 第84-86页 |
| 第五章 猪瘟Shimen 株致猪血管内皮细胞病变前后表达差异基因的寻找 | 第86-115页 |
| ·材料 | 第87-88页 |
| ·细胞和毒株 | 第87页 |
| ·试剂 | 第87-88页 |
| ·随机引物和锚定引物 | 第88页 |
| ·主要仪器设备 | 第88页 |
| ·方法 | 第88-95页 |
| ·猪瘟Shimen 株感染猪血管内皮细胞后细胞病变(CPE)的观察 | 第88页 |
| ·猪瘟Shimen 株感染猪血管内皮细胞病变前后RNA 提取 | 第88-89页 |
| ·RNA 的纯化 | 第89页 |
| ·cDNA 第一条链的合成 | 第89-90页 |
| ·PCR 反应条件的筛选 | 第90页 |
| ·PCR 反应程序的选择 | 第90页 |
| ·PCR 反应体系的选择 | 第90页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第90-91页 |
| ·电泳装置的安装 | 第90-91页 |
| ·制备6%聚丙烯酰胺凝胶溶液 | 第91页 |
| ·测序胶的安装 | 第91页 |
| ·加样和电泳 | 第91页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶染色 | 第91页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳差异条带的回收 | 第91-92页 |
| ·差异条带的二次PCR 及电泳检测 | 第92页 |
| ·利用反向Northern 点杂交筛选阳性差异条带 | 第92-93页 |
| ·探针标记 | 第92页 |
| ·反向Northern 点杂交 | 第92页 |
| ·BCIP/NBT 显色 | 第92-93页 |
| ·纯化回收阳性差异条带的DNA 片段 | 第93页 |
| ·纯化产物与PMD18-T Vector 连接 | 第93页 |
| ·新鲜感受态细胞的制备(CaCl_2法) | 第93-94页 |
| ·连接产物的转化 | 第94页 |
| ·重组质粒的提取 | 第94-95页 |
| ·溶液的配制 | 第94-95页 |
| ·重组质粒的提取的操作方法 | 第95页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第95页 |
| ·序列测定 | 第95页 |
| ·序列同源性分析 | 第95页 |
| ·结果 | 第95-113页 |
| ·RNA 的提取 | 第95-96页 |
| ·PCR 反应条件的筛选 | 第96-97页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第97-100页 |
| ·差异条带二次PCR | 第100-101页 |
| ·差异带的反向Northern 点杂交 | 第101页 |
| ·差异带的克隆及序列分析 | 第101-113页 |
| ·重组质粒酶切鉴定 | 第101-102页 |
| ·序列测定 | 第102-105页 |
| ·序列同源性分析结果 | 第105-113页 |
| ·讨论 | 第113-114页 |
| ·mRNA 差异显示过程中一些问题的探讨 | 第113-114页 |
| ·RNA 的提取与反转录 | 第113页 |
| ·PCR 扩增条件 | 第113页 |
| ·DDRT-PCR 扩增产物的显示、回收、再扩增 | 第113-114页 |
| ·差异条带的真实性验证 | 第114页 |
| ·结论 | 第114-115页 |
| 第六章 猪瘟Shimen 株E2基因哺乳动物细胞表达 | 第115-127页 |
| ·材料 | 第115-117页 |
| ·毒株、菌株与表达系统 | 第116页 |
| ·酶与试剂 | 第116页 |
| ·各种细胞培养基配制 | 第116-117页 |
| ·细胞培养用试剂 | 第116页 |
| ·细胞消化用试剂 | 第116-117页 |
| ·主要仪器 | 第117页 |
| ·引物的设计与合成 | 第117页 |
| ·方法 | 第117-120页 |
| ·Shimen E2 基因的克隆和鉴定 | 第117-118页 |
| ·RNA 的提取 | 第117页 |
| ·反转录合成cDNA | 第117页 |
| ·PCR 和nPCR | 第117-118页 |
| ·纯化回收DNA 片段 | 第118页 |
| ·纯化产物与PMD18-T Vector 连接 | 第118页 |
| ·连接产物的转化、涂板、重组质粒的提取 | 第118页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第118页 |
| ·重组表达载体的构建与鉴定 | 第118-119页 |
| ·重组真核质粒转染PK-15 细胞及筛选 | 第119页 |
| ·阳性细胞的免疫组化试验 | 第119页 |
| ·夹心ELISA 鉴定转染细胞中Shimen 株病毒抗原 | 第119-120页 |
| ·结果 | 第120-124页 |
| ·猪瘟Shimen 株E2 基因的克隆 | 第120页 |
| ·表达引物PCR 扩增 | 第120-121页 |
| ·真核表达质粒的构建图 | 第121页 |
| ·真核表达质粒的PCR 和酶切鉴定 | 第121-122页 |
| ·PEGFP-E2 的核苷酸测序结果 | 第122页 |
| ·PEGFP-E2 的氨基酸序列结果 | 第122页 |
| ·阳性细胞克隆的PCR 鉴定 | 第122-123页 |
| ·阳性细胞克隆的荧光鉴定 | 第123页 |
| ·阳性细胞克隆的免疫组化试验 | 第123-124页 |
| ·夹心ELISA 鉴定转染细胞中Shimen 株病毒抗原 | 第124页 |
| ·讨论 | 第124-126页 |
| ·小结 | 第126-127页 |
| 结论 | 第127-128页 |
| 参考文献 | 第128-141页 |
| 致 谢 | 第141-142页 |
| 作者简介 | 第142页 |
