| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-13页 |
| 第一章 绪论 | 第13-23页 |
| ·纤维素及纤维素酶研究 | 第13-15页 |
| ·丝状真菌纤维素酶基因的克隆和纤维素酶的转录调控 | 第15-18页 |
| ·丝状真菌纤维素酶基因的克隆 | 第15页 |
| ·丝状真菌纤维素酶基因的转录调控 | 第15-18页 |
| ·未知基因的克隆策略 | 第18-22页 |
| ·TAIL-PCR的方法和原理 | 第18-20页 |
| ·SEFA-PCR的方法和原理 | 第20-22页 |
| ·本研究的主要工作和意义 | 第22-23页 |
| 第二章 斜卧青霉野生株114-2和突变株JU-A10胞外纤维素降解酶系的比较 | 第23-34页 |
| 引言 | 第23页 |
| ·材料和方法 | 第23-28页 |
| ·菌株及培养条件 | 第23-24页 |
| ·常用储备液及缓冲液 | 第24-25页 |
| ·比酶活及菌体生长量测定相关的储备液及缓冲液 | 第24页 |
| ·SDS-PAGE及PAGE所需储备液及缓冲液 | 第24-25页 |
| ·活性染色所需储备液及缓冲液 | 第25页 |
| ·试剂与仪器 | 第25页 |
| ·酶活力测定 | 第25-26页 |
| ·菌体生长量与蛋白含量测定 | 第26页 |
| ·SDS-PAGE、内切葡聚糖酶及木聚糖酶的活性染色 | 第26-27页 |
| ·PAGE及外切葡聚糖酶与β-葡萄糖苷酶的活性染色 | 第27-28页 |
| ·结果与分析 | 第28-32页 |
| ·在诱导与阻遏条件下出发株和突变株胞外纤维素酶系合成的定性比较 | 第28-30页 |
| ·在诱导条件下出发株和突变株胞外纤维素酶系合成的定量比较 | 第30-32页 |
| ·小结 | 第32-34页 |
| 第三章 斜卧青霉木质纤维素酶CBH1的基因克隆及出发菌株114—2和突变菌株JU-A10 CBH1的基因序列比对 | 第34-52页 |
| 引言 | 第34页 |
| ·材料和方法 | 第34-42页 |
| ·菌株和培养基 | 第34-35页 |
| ·常用储备液及缓冲液 | 第35页 |
| ·试剂、工具酶与仪器 | 第35-36页 |
| ·基因组DNA的提取与定量 | 第36页 |
| ·简并引物设计与PCR扩增 | 第36-37页 |
| ·TAIL-PCR扩增基因5'端和3'端 | 第37-39页 |
| ·高保真扩增基因全长 | 第39页 |
| ·克隆、测序与序列分析 | 第39-40页 |
| ·DNA片段的回收与克隆 | 第39-40页 |
| ·序列测定与分析 | 第40页 |
| ·全长引物设计与PCR扩增 | 第40页 |
| ·总RNA的提取及cDNA的合成 | 第40-42页 |
| ·结果与分析 | 第42-51页 |
| ·基因组DNA的质量 | 第42页 |
| ·斜卧青霉cbh1基因的克隆及序列分析 | 第42-51页 |
| ·斜卧青霉cbh1基因片段的克隆 | 第42-44页 |
| ·TAIL-PCR扩增cbh1基因5'端和3'端序列 | 第44-45页 |
| ·TAIL-PCR扩增cbh1基因3'端序列 | 第45-46页 |
| ·cbh1全长基因的克隆 | 第46-47页 |
| ·RT-PCR扩增cbh1 cDNA | 第47-49页 |
| ·cbh1上游序列的扩增 | 第49-51页 |
| ·小结 | 第51-52页 |
| 第四章 斜卧青霉CBH1基因在毕赤酵母中表达 | 第52-68页 |
| 引言 | 第52页 |
| ·实验材料 | 第52-55页 |
| ·菌株和质粒 | 第52-53页 |
| ·分子克隆用酶和试剂及仪器 | 第53页 |
| ·培养基和溶液 | 第53-55页 |
| ·实验方法 | 第55-62页 |
| ·菌种的活化培养 | 第55页 |
| ·pUC19-cbh1质粒的提取 | 第55页 |
| ·目的基因cbh1的PCR扩增 | 第55-56页 |
| ·重组质粒pPIC9K-cbh1的构建 | 第56-57页 |
| ·载体质粒pPIC9K的提取 | 第56页 |
| ·目的基因与载体的限制性内切酶消化反应 | 第56页 |
| ·线状载体质粒pPIC9K的去磷酸化处理 | 第56-57页 |
| ·目的基因与载体的连接反应 | 第57页 |
| ·大肠杆菌转化 | 第57-58页 |
| ·大肠杆菌超级感受态细胞的制备 | 第57页 |
| ·目的片段转化大肠杆菌 | 第57页 |
| ·大肠杆菌转化子的验证 | 第57-58页 |
| ·重组质粒与毕赤酵母基因组的同源整合 | 第58-60页 |
| ·重组质粒的线性化 | 第58-59页 |
| ·毕赤酵母电转化 | 第59-60页 |
| ·酵母基因组DNA的简易高效提法 | 第60页 |
| ·外源蛋白在毕赤酵母中的表达与检测 | 第60-62页 |
| ·外源蛋白的诱导表达 | 第60-61页 |
| ·胞外蛋白表达情况的SDS-PAGE检测 | 第61页 |
| ·酶活性测定 | 第61-62页 |
| ·实验结果 | 第62-67页 |
| ·目的基因cbh1的PCR引物设计 | 第62页 |
| ·重组质粒pPIC9K-cbh1的构建 | 第62-63页 |
| ·目的基因cbh1的PCR扩增 | 第63页 |
| ·载体质粒与目的基因的酶切、连接 | 第63-64页 |
| ·连接液转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的筛选 | 第64-65页 |
| ·连接液转化大肠杆菌感受态细胞 | 第64页 |
| ·转化子的验证 | 第64-65页 |
| ·毕赤酵母电转化及重组酵母菌的筛选 | 第65-66页 |
| ·毕赤酵母电转化 | 第65页 |
| ·酵母转化子的PCR鉴定 | 第65-66页 |
| ·SDS-PAGE检测工程菌表达目的蛋白的结果 | 第66-67页 |
| ·粗酶液的制备 | 第66页 |
| ·酵母重组子表达rCBH I酶活测定 | 第66-67页 |
| ·小结 | 第67-68页 |
| 第五章 斜卧青霉β-葡萄糖苷酶基因的克隆 | 第68-81页 |
| 引言 | 第68页 |
| ·材料和方法 | 第68-72页 |
| ·菌株和培养基 | 第68页 |
| ·常用储备液及缓冲液 | 第68-69页 |
| ·试剂、工具酶与仪器 | 第69页 |
| ·基因组DNA的提取与定量 | 第69页 |
| ·简并引物设计与PCR扩增 | 第69-70页 |
| ·TAIL-PCR扩增基因5'端和3'端 | 第70页 |
| ·SEFA-PCR扩增基因 | 第70-71页 |
| ·高保真扩增基因全长 | 第71-72页 |
| ·克隆、测序与序列分析 | 第72页 |
| ·DNA片段的回收与克隆 | 第72页 |
| ·序列测定与分析 | 第72页 |
| ·总RNA的提取及cDNA的合成 | 第72页 |
| ·结果与分析 | 第72-81页 |
| ·斜卧青霉bgl1基因片段的克隆 | 第72-74页 |
| ·TAIL-PCR扩增bgl1基因5'端和3'端序列 | 第74-76页 |
| ·TAIL-PCR扩增bgl1基因5'端序列 | 第76页 |
| ·用SEFA-PCR扩增bgl1 3'端序列 | 第76-77页 |
| ·bgl1全长基因的克隆和cDNA克隆 | 第77-81页 |
| 全文总结 | 第81-83页 |
| 参考文献 | 第83-87页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第87-88页 |
| 致谢 | 第88页 |
