| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 第一章 绪论 | 第13-20页 |
| 1.1 蜘蛛毒素的简介及研究进展 | 第13-15页 |
| 1.1.1 毒素简介 | 第13页 |
| 1.1.2 蜘蛛简介 | 第13-15页 |
| 1.1.3 获取毒素的方法 | 第15页 |
| 1.2 蛋白的表达及纯化研究进展 | 第15-18页 |
| 1.2.1 蛋白的表达 | 第15-17页 |
| 1.2.2 蛋白的纯化 | 第17-18页 |
| 1.3 表达融合蛋白标签的选用 | 第18-20页 |
| 1.3.1 HIS标签 | 第18页 |
| 1.3.2 GST标签 | 第18页 |
| 1.3.3 Flag标签 | 第18-19页 |
| 1.3.4 SUMO标签 | 第19页 |
| 1.3.5 EGFP标签 | 第19-20页 |
| 第二章 蜘蛛神经毒素HNTX Ⅲ在大肠杆菌中的异源表达及纯化 | 第20-37页 |
| 2.1 前言 | 第20-21页 |
| 2.1.1 毒素海南三简介 | 第20-21页 |
| 2.2 材料 | 第21-23页 |
| 2.2.1 实验材料 | 第21页 |
| 2.2.2 主要仪器 | 第21页 |
| 2.2.3 实验试剂 | 第21-22页 |
| 2.2.4 主要溶液的配制 | 第22-23页 |
| 2.3 实验方法 | 第23-31页 |
| 2.3.1 制备DH5α感受态细胞 | 第23-24页 |
| 2.3.2 构建原核表达载体 | 第24-27页 |
| 2.3.3原核表达SUMO激酶UPL1 | 第27-28页 |
| 2.3.4 原核表达和纯化毒素HNTX Ⅲ | 第28页 |
| 2.3.5 超滤管回收 | 第28-29页 |
| 2.3.6 毒素透析 | 第29页 |
| 2.3.7 毒素HNTX Ⅲ酶切 | 第29页 |
| 2.3.8 毒素HNTX Ⅲ酶切后纯化并鉴定 | 第29-30页 |
| 2.3.9 Tricine-SDS-PAGE胶考染鉴定 | 第30页 |
| 2.3.10 质谱鉴定HNTX Ⅲ分子量 | 第30页 |
| 2.3.11 细胞培养及处理 | 第30页 |
| 2.3.12 Lipo2000转染细胞 | 第30-31页 |
| 2.3.13 全细胞膜片钳活性鉴定 | 第31页 |
| 2.4 实验结果 | 第31-36页 |
| 2.4.1 pET-43a-HIS-SUMO-HNTX Ⅲ载体的构建 | 第31页 |
| 2.4.2 HIS-SUMO-HNTX Ⅲ在S Huffle~(TM)菌中的表达 | 第31-32页 |
| 2.4.3 rHNTX Ⅲ通过亲和色谱法和超滤管纯化 | 第32-34页 |
| 2.4.4 rHNTX Ⅲ通过全细胞膜片钳实验鉴定其活性 | 第34-36页 |
| 2.5 讨论 | 第36-37页 |
| 第三章 毒素ProTX Ⅱ、GsAF Ⅱ及其突变体在大肠杆菌中的异源表达及纯化 | 第37-55页 |
| 3.1 前言 | 第37-38页 |
| 3.1.1 毒素GsAF Ⅱ和ProTX Ⅱ简介 | 第37-38页 |
| 3.2 材料 | 第38页 |
| 3.3 实验方法 | 第38-45页 |
| 3.3.1 制备S Huffle~(TM)感受态细胞 | 第38-39页 |
| 3.3.2 构建原核表达载体 | 第39页 |
| 3.3.3 构建原核表达突变体载体 | 第39-41页 |
| 3.3.4 中量提取质粒(使用英韦创津公司中量提取质粒试剂盒) | 第41-42页 |
| 3.3.5 重组毒素及其突变体的表达和纯化 | 第42页 |
| 3.3.6 超滤管回收 | 第42页 |
| 3.3.7 毒素透析 | 第42-43页 |
| 3.3.8 毒素ProTX Ⅱ、GsAF Ⅱ、YC1等的酶切 | 第43页 |
| 3.3.9 毒素ProTX Ⅱ、GsAF Ⅱ、YC1等酶切后纯化并鉴定 | 第43页 |
| 3.3.10 Tricine-SDS-PAGE胶考染鉴定 | 第43-44页 |
| 3.3.11 改良型Bradford法测蛋白浓度 | 第44页 |
| 3.3.12 细胞培养及处理 | 第44-45页 |
| 3.3.13 Lipo2000转染细胞 | 第45页 |
| 3.3.14 全细胞膜片钳检测 | 第45页 |
| 3.4 实验结果 | 第45-53页 |
| 3.4.1 pET-43a-GST-SUMO-ProTX Ⅱ、pET-43a-GST-SUMO-GsAF Ⅱ及其突变体载体的构建 | 第45-46页 |
| 3.4.2 GST-SUMO-ProTX Ⅱ等在S Huffle~(TM)菌中的表达 | 第46-47页 |
| 3.4.3 rProTX Ⅱ等通过亲和色谱法和超滤管纯化 | 第47-52页 |
| 3.4.4 rYC1通过全细胞膜片钳实验鉴定其活性 | 第52-53页 |
| 3.5 讨论 | 第53-55页 |
| 第四章 敬钊粗毒对RLR和TLR信号通路的影响 | 第55-79页 |
| 4.1 前言 | 第55-61页 |
| 4.1.1 免疫及免疫应答 | 第55页 |
| 4.1.2 RLR信号通路介绍 | 第55-59页 |
| 4.1.3 TLR信号通路介绍 | 第59-61页 |
| 4.2 材料 | 第61页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第61页 |
| 4.2.2 实验仪器 | 第61页 |
| 4.3 实验方法 | 第61-64页 |
| 4.3.1 敬钊粗毒测定浓度 | 第61-62页 |
| 4.3.2 敬钊粗毒刺激细胞 | 第62页 |
| 4.3.3 提取毒素刺激细胞的RNA | 第62页 |
| 4.3.4 RNA的逆转录 | 第62页 |
| 4.3.5 荧光定量PCR | 第62-64页 |
| 4.4 实验结果 | 第64-78页 |
| 4.4.1 敬钊粗毒刺激细胞后免疫相关基因的mRNA表达情况 | 第64-78页 |
| 4.5 讨论 | 第78-79页 |
| 第五章 青鱼IFNb的分子克隆、在真核细胞中的蛋白表达及功能鉴定 | 第79-105页 |
| 5.1 前言 | 第79-81页 |
| 5.1.1 哺乳动物干扰素的简介及研究进展 | 第79-80页 |
| 5.1.2 鱼类干扰素的简介及研究进展 | 第80-81页 |
| 5.2 材料 | 第81-82页 |
| 5.2.1 实验材料 | 第81页 |
| 5.2.2 实验试剂 | 第81页 |
| 5.2.3 主要溶液的配制 | 第81-82页 |
| 5.3 实验方法 | 第82-90页 |
| 5.3.1 提取青鱼细胞的RNA | 第82页 |
| 5.3.2 RNA的逆转录 | 第82页 |
| 5.3.3 设计引物 | 第82-83页 |
| 5.3.4 构建载体 | 第83-84页 |
| 5.3.5 western blotting检测bcIFNb蛋白的表达 | 第84-86页 |
| 5.3.6 免疫荧光检测bcIFNb的定位 | 第86页 |
| 5.3.7 GCRV和SVCV病毒的生产 | 第86页 |
| 5.3.8 病毒滴度的测定 | 第86-87页 |
| 5.3.9 病毒的感染实验 | 第87页 |
| 5.3.10 蛋白的糖基化酶切 | 第87页 |
| 5.3.11 ELISA测定蛋白浓度 | 第87-88页 |
| 5.3.12 构建糖基化突变体 | 第88-90页 |
| 5.4 实验结果 | 第90-104页 |
| 5.4.1 bcIFNb的分子克隆 | 第90-91页 |
| 5.4.2 bcIFNb的分子特征 | 第91-93页 |
| 5.4.3 bcIFNb蛋白表达 | 第93-94页 |
| 5.4.4 bcIFNb的mRNA分析 | 第94-95页 |
| 5.4.5 bcIFNb细胞内定位 | 第95-96页 |
| 5.4.6 过表达bcIFNb对GCRV的抗病作用 | 第96-97页 |
| 5.4.7 过表达bcIFNb对SVCV的抗病作用 | 第97-98页 |
| 5.4.8 分泌的bcIFNb对GCRV的抗病作用 | 第98-99页 |
| 5.4.9 分泌的bcIFNb对SVCV的抗病作用 | 第99-101页 |
| 5.4.10 bcIFNb蛋白具有糖基化作用 | 第101-102页 |
| 5.4.11 bcIFNb的糖基化作用不影响其本身的抗病效应 | 第102-104页 |
| 5.5 讨论 | 第104-105页 |
| 第六章 总结与展望 | 第105-108页 |
| 致谢 | 第108-109页 |
| 参考文献 | 第109-120页 |
| 博士期间发表的论文情况 | 第120-121页 |
| 附录A 缩写 | 第121页 |
