| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 英文缩略词 | 第9-10页 |
| 1 引言 | 第10-18页 |
| 2 实验材料与试剂 | 第18-24页 |
| 2.1 实验材料 | 第18页 |
| 2.2 主要试剂、酶类 | 第18-20页 |
| 2.3 菌株和质粒 | 第20页 |
| 2.4 主要试剂配制 | 第20-21页 |
| 2.5 主要仪器设备 | 第21-23页 |
| 2.6 计算机软件及数据库 | 第23-24页 |
| 3 实验方法 | 第24-36页 |
| 3.1 EstL5的序列分析和克隆 | 第24-25页 |
| 3.1.1 EstL5的序列分析 | 第24页 |
| 3.1.2 制备大肠杆菌感受态细胞 | 第24页 |
| 3.1.3 原核表达质粒的构建 | 第24-25页 |
| 3.2 EstL5融合蛋白的表达与纯化 | 第25-27页 |
| 3.2.1 EstL5 融合蛋白的表达 | 第25页 |
| 3.2.2 EstL5 融合蛋白的纯化 | 第25-26页 |
| 3.2.3 SDS 聚丙烯酰胺凝胶配制方法 | 第26页 |
| 3.2.4 超滤操作方法 | 第26页 |
| 3.2.5 纯化蛋白溶液浓度的测定 | 第26-27页 |
| 3.3 EstL5的酯酶活性测定 | 第27-29页 |
| 3.3.1 酯酶EstL5最适底物测定 | 第27-28页 |
| 3.3.2 酯酶EstL5最适反应pH值与最适反应温度条件测定 | 第28页 |
| 3.3.3 酯酶EstL5的热稳定性测定 | 第28-29页 |
| 3.3.4 酯酶EstL5在不同pH条件下稳定性测定 | 第29页 |
| 3.3.5 酯酶EstL5在不同盐组分或化合物条件下稳定性测定 | 第29页 |
| 3.4 结晶EstL5的表达纯化 | 第29-30页 |
| 3.4.1 EstL5的分子筛纯化 | 第29-30页 |
| 3.5 EstL5蛋白结晶条件的筛选和优化 | 第30页 |
| 3.5.1 EstL5蛋白结晶条件的筛选 | 第30页 |
| 3.5.2 EstL5蛋白结晶条件的优化 | 第30页 |
| 3.6 硒代EstL5的表达纯化 | 第30-32页 |
| 3.6.1 硒代EstL5的表达使用的M9培养基的配制 | 第30-31页 |
| 3.6.2 硒代EstL5的诱导表达 | 第31页 |
| 3.6.3 硒代EstL5的纯化 | 第31页 |
| 3.6.4 硒代EstL5的鉴定 | 第31页 |
| 3.6.5 硒代EstL5的结晶条件筛选 | 第31-32页 |
| 3.7 衍射数据收集和结构解析 | 第32-33页 |
| 3.7.1 防冻剂筛选 | 第32页 |
| 3.7.2 X-射线衍射数据的收集 | 第32页 |
| 3.7.3 硒代EstL5的结构解析 | 第32-33页 |
| 3.7.4 野生型EstL5的结构解析 | 第33页 |
| 3.7.5 EstL5与底物复合体的晶体筛选 | 第33页 |
| 3.8 EstL5的突变体构建与表达纯化 | 第33-36页 |
| 3.8.1 引物设计 | 第33-34页 |
| 3.8.2 突变体表达质粒的构建 | 第34页 |
| 3.8.3 突变体的表达纯化 | 第34-35页 |
| 3.8.4 突变体的酯酶活力测定 | 第35页 |
| 3.8.5 突变体的热稳定性简单测定 | 第35-36页 |
| 4 结果和讨论 | 第36-80页 |
| 4.1 EstL5的克隆纯化与活性检测 | 第36-47页 |
| 4.1.1 EstL5的序列分析 | 第36-37页 |
| 4.1.2 EstL5的基因克隆 | 第37页 |
| 4.1.3 EstL5的表达纯化 | 第37-39页 |
| 4.1.4 EstL5的酯酶活性测定 | 第39-47页 |
| 4.2 EstL5的结构解析 | 第47-64页 |
| 4.2.1 EstL5的晶体制备 | 第47-49页 |
| 4.2.2 硒代EstL5的晶体制备 | 第49-54页 |
| 4.2.3 衍射数据收集 | 第54-55页 |
| 4.2.4 硒代EstL5的结构解析 | 第55-56页 |
| 4.2.5 硒代EstL5模型质量分析 | 第56-60页 |
| 4.2.6 野生型EstL5的晶体结构解析 | 第60页 |
| 4.2.7 EstL5模型质量分析 | 第60-64页 |
| 4.3 EstL5的结构与催化机理 | 第64-80页 |
| 4.3.1 野生型EstL5与硒代EstL5的结构比较 | 第64页 |
| 4.3.2 EstL5的晶体结构分析 | 第64-70页 |
| 4.3.3 突变体的活性检测 | 第70-73页 |
| 4.3.4 EstL5的催化机制的讨论 | 第73-78页 |
| 4.3.5 复合体晶体筛选 | 第78-80页 |
| 小结 | 第80页 |
| 展望 | 第80-81页 |
| 综述 | 第81-104页 |
| 参考文献 | 第96-104页 |
| 在读期间发表论文 | 第104-105页 |
| 致谢 | 第105-106页 |
