| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-13页 |
| 引言 | 第13-23页 |
| 1 ASFV 的病原学 | 第13-16页 |
| ·ASFV 主要编码蛋白的功能 | 第14-15页 |
| ·ASFV 的免疫抑制与免疫逃避 | 第15-16页 |
| ·抑制宿主基因的转录 | 第15页 |
| ·抑制宿主淋巴细胞的启动 | 第15-16页 |
| ·对宿主细胞凋亡的干扰 | 第16页 |
| 2 非洲猪瘟的流行病学 | 第16-18页 |
| ·ASF 的地理分布 | 第16-17页 |
| ·ASF 的易感动物 | 第17页 |
| ·ASF 的传播途径 | 第17-18页 |
| 3 非洲猪瘟的临床症状及病理变化 | 第18-19页 |
| ·急性型 | 第18-19页 |
| ·亚急性型 | 第19页 |
| ·慢性型 | 第19页 |
| 4 非洲猪瘟的诊断技术 | 第19-22页 |
| ·针对毒株本身的检测 | 第19页 |
| ·对病毒基因组DNA 的检测 | 第19-20页 |
| ·常规PCR | 第19-20页 |
| ·原位杂交技术 | 第20页 |
| ·巢式PCR | 第20页 |
| ·实时荧光定量PCR 技术 | 第20页 |
| ·血清学方法 | 第20-21页 |
| ·荧光抗体法 | 第20-21页 |
| ·ELISA | 第21页 |
| ·间接荧光抗体法 | 第21页 |
| ·免疫印迹 | 第21页 |
| ·其它检测方法 | 第21-22页 |
| ·免疫传感器 | 第21-22页 |
| ·入侵分析 | 第22页 |
| 5 本研究的目的与意义 | 第22-23页 |
| 研究一 非洲猪瘟病毒K205R 基因的克隆和鉴定 | 第23-31页 |
| 1 材料与方法 | 第23-27页 |
| ·材料 | 第23-24页 |
| ·非洲猪瘟病毒基因组DNA | 第23页 |
| ·菌株与载体 | 第23页 |
| ·试剂与药品 | 第23页 |
| ·仪器与耗材 | 第23-24页 |
| ·核酸电泳相关溶液 | 第24页 |
| ·细菌培养相关溶液 | 第24页 |
| ·方法 | 第24-27页 |
| ·扩增K205R 基因引物的设计 | 第24页 |
| ·PCR 反应体系及条件 | 第24-25页 |
| ·PCR 产物的回收 | 第25-26页 |
| ·重组质粒pEASY-T1-K205R 的连接 | 第26页 |
| ·重组质粒pEASY-T1-K205R 的转化 | 第26页 |
| ·重组质粒pEASY-T1-K205R 的PCR 鉴定 | 第26页 |
| ·重组质粒pEASY-T1-K205R 的提取 | 第26-27页 |
| ·重组质粒pEASY-T1-K205R 的双酶切鉴定 | 第27页 |
| ·序列测定 | 第27页 |
| 2 结果 | 第27-30页 |
| ·非洲猪瘟病毒K205R 基因的PCR 扩增 | 第27-28页 |
| ·重组质粒PEASY-T1-K205R 的构建 | 第28页 |
| ·序列测定与分析 | 第28-30页 |
| 3 讨论 | 第30-31页 |
| 研究二 非洲猪瘟病毒K205R 基因实时荧光定量PCR检测方法的建立与评价 | 第31-40页 |
| 1 材料与方法 | 第31-33页 |
| ·材料 | 第31页 |
| ·宿主组织及对照品 | 第31页 |
| ·试剂与药品 | 第31页 |
| ·仪器与耗材 | 第31页 |
| ·方法 | 第31-33页 |
| ·引物及探针设计 | 第31-32页 |
| ·质粒模板的制备 | 第32页 |
| ·模拟样品的制备 | 第32页 |
| ·基于K205R 基因的实时荧光PCR 方法的建立 | 第32-33页 |
| ·基于K205R 基因的实时荧光PCR 的敏感性测定 | 第33页 |
| ·基于K205R 基因的实时荧光PCR 的特异性测定 | 第33页 |
| ·基于p72 的实时荧光PCR 的敏感性测定 | 第33页 |
| ·基于p72 的实时荧光PCR 的特异性测定 | 第33页 |
| 2 结果 | 第33-39页 |
| ·基于K205R 基因的实时荧光PCR 方法的建立 | 第33-35页 |
| ·反应体系中Mg~(2+)浓度优化结果 | 第33-34页 |
| ·引物浓度和退火温度优化结果 | 第34页 |
| ·最终反应体系及反应条件确定结果 | 第34-35页 |
| ·基于K205R 基因的实时荧光PCR 的敏感性测定结果 | 第35-36页 |
| ·基于K205R 基因的实时荧光PCR 的特异性测定结果 | 第36页 |
| ·基于P72 的实时荧光PCR 反应体系与反应条件确定结果 | 第36-37页 |
| ·基于P72 的实时荧光PCR 的敏感性测定结果 | 第37-38页 |
| ·基于P72 的实时荧光PCR 的特异性测定结果 | 第38-39页 |
| 3 讨论 | 第39-40页 |
| 研究三 非洲猪瘟病毒PK205R 蛋白的表达与纯化 | 第40-49页 |
| 1 材料与方法 | 第40-45页 |
| ·材料 | 第40-42页 |
| ·菌株与载体 | 第40页 |
| ·试剂与药品 | 第40-41页 |
| ·仪器与耗材 | 第41页 |
| ·所用溶液的配制 | 第41-42页 |
| ·方法 | 第42-45页 |
| ·重组质粒pQE30-K205R 的构建 | 第42页 |
| ·大肠杆菌M15 感受态细胞的制备（CaC12 法） | 第42-43页 |
| ·重组质粒pQE30-K205R 的转化 | 第43页 |
| ·重组质粒pQE30-K205R 的PCR 鉴定 | 第43页 |
| ·重组质粒pQE30-K205R 的双酶切鉴定 | 第43页 |
| ·重组菌的诱导表达 | 第43-44页 |
| ·重组菌表达条件的优化 | 第44页 |
| ·融合蛋白His-K205R 的Western Blot 分析 | 第44页 |
| ·融合蛋白His-K205R 的可溶性分析 | 第44页 |
| ·融合蛋白His-K205R 的纯化 | 第44-45页 |
| 2 结果 | 第45-48页 |
| ·重组质粒PQE30-K205R 构建结果 | 第45-46页 |
| ·重组菌诱导表达条件确定结果 | 第46-47页 |
| ·融合蛋白的WESTERN BLOT 分析 | 第47页 |
| ·融合蛋白的可溶性分析及纯化 | 第47-48页 |
| 3 讨论 | 第48-49页 |
| 研究四 非洲猪瘟病毒PK205R 蛋白的免疫学分析 | 第49-55页 |
| 1 材料与方法 | 第49-52页 |
| ·材料 | 第49-50页 |
| ·实验动物 | 第49页 |
| ·试剂与药品 | 第49页 |
| ·仪器与耗材 | 第49页 |
| ·ELISA 部分相关试剂的配制 | 第49-50页 |
| ·方法 | 第50-52页 |
| ·反应封闭液的选择 | 第50页 |
| ·最佳二抗稀释度的确定 | 第50-51页 |
| ·抗原最佳包被量的确定 | 第51页 |
| ·融合蛋白的反应原性检测 | 第51页 |
| ·融合蛋白的动物免疫试验 | 第51页 |
| ·检测免疫小鼠抗体水平 | 第51页 |
| ·融合蛋白的免疫原性检测 | 第51-52页 |
| 2 结果 | 第52-54页 |
| ·反应封闭液选择结果 | 第52页 |
| ·二抗稀释度确定结果 | 第52页 |
| ·抗原最佳包被浓度确定结果 | 第52-53页 |
| ·融合蛋白反应原性测定结果 | 第53页 |
| ·免疫小鼠抗体水平检测结果 | 第53页 |
| ·融合蛋白免疫原性测定结果 | 第53-54页 |
| 3 讨论 | 第54-55页 |
| 结论 | 第55-56页 |
| 致谢 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-63页 |
| 作者简介 | 第63页 |
