| 摘要 | 第7-9页 |
| ABSTRACT | 第9-10页 |
| 第一章 绪论 | 第11-31页 |
| 1.1 腈化合物与腈水解酶概述 | 第11-16页 |
| 1.1.1 腈水解酶的来源和分类 | 第12-13页 |
| 1.1.2 腈水解酶的结构及其酶的作用机制 | 第13-15页 |
| 1.1.3 腈水解酶基因克隆与表达 | 第15-16页 |
| 1.2 腈水解酶的应用 | 第16-19页 |
| 1.2.1 腈水解酶的立体选择性 | 第17页 |
| 1.2.2 腈水解酶的区域选择性 | 第17-18页 |
| 1.2.3 腈水解酶在有机合成方面的应用 | 第18页 |
| 1.2.4 腈水解酶在生物降解方面的应用 | 第18-19页 |
| 1.3 腈水解酶在生产草甘膦方面的应用 | 第19-22页 |
| 1.3.1 草甘膦的生产方法和用途 | 第19-20页 |
| 1.3.2 亚氨基二乙酸的其他应用 | 第20-21页 |
| 1.3.2.1 鳌合剂 | 第20页 |
| 1.3.2.2 回收以及精制有价值的金属 | 第20页 |
| 1.3.2.3 增光剂与缓凝剂 | 第20页 |
| 1.3.2.4 分离纯化剂 | 第20-21页 |
| 1.3.2.5 表面活性剂 | 第21页 |
| 1.3.2.6 其他应用 | 第21页 |
| 1.3.3 腈水解酶用于生产亚氨基二乙酸 | 第21-22页 |
| 1.4 结语与展望 | 第22-24页 |
| 1.5 本论文的研究内容 | 第24-25页 |
| 参考文献 | 第25-31页 |
| 第二章 腈水解酶基因的结构分析,克隆表达与分离纯化 | 第31-53页 |
| 2.1 引言 | 第31页 |
| 2.2 材料与方法 | 第31-41页 |
| 2.2.1 材料 | 第31-34页 |
| 2.2.1.1 菌种与质粒 | 第31-32页 |
| 2.2.1.2 培养基 | 第32页 |
| 2.2.1.3 工具酶 | 第32页 |
| 2.2.1.4 试剂 | 第32-33页 |
| 2.2.1.5 主要实验仪器 | 第33-34页 |
| 2.2.2 实验方法 | 第34-41页 |
| 2.2.2.1 腈水解酶基因的筛选与基因的获得 | 第34页 |
| 2.2.2.2 腈水解酶基因的克隆 | 第34-35页 |
| 2.2.2.3 电泳检测PCR产物 | 第35-36页 |
| 2.2.2.4 目的基因与表达载体的连接 | 第36-37页 |
| 2.2.2.5 重组表达质粒的构建 | 第37页 |
| 2.2.2.6 大肠杆菌E.coliJM109感受态的制备及转化程序 | 第37-38页 |
| 2.2.2.7 碱裂解法提取质粒 | 第38-39页 |
| 2.2.2.8 大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态的制备及转化程序 | 第39页 |
| 2.2.2.9 重组质粒的序列测定 | 第39页 |
| 2.2.2.10 诱导表达,分离纯化与SDS-PAGE分析 | 第39-40页 |
| 2.2.2.11 腈水解酶的同源建模与分子对接 | 第40-41页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第41-50页 |
| 2.3.1 腈水解酶基因序列的筛选 | 第41-42页 |
| 2.3.2 腈水解酶的原核表达载体的构建 | 第42页 |
| 2.3.3 腈水解酶的分离纯化 | 第42-43页 |
| 2.3.4 SDS-PAGE检测 | 第43-44页 |
| 2.3.5 腈水解酶序列、结构分析与催化机制分析 | 第44-50页 |
| 2.3.5.1 腈水解酶的模拟结构 | 第44-45页 |
| 2.3.5.2 腈水解酶的分类 | 第45-47页 |
| 2.3.5.3 不同类型腈水解酶三维结构比较 | 第47-48页 |
| 2.3.5.4 不同类型腈水解酶三维结构的比较 | 第48-50页 |
| 2.4 本章小结 | 第50页 |
| 参考文献 | 第50-53页 |
| 第三章 腈水解酶酶学性质的研究 | 第53-62页 |
| 3.1 引言 | 第53页 |
| 3.2 材料与方法 | 第53-54页 |
| 3.2.1 菌种与培养基 | 第53页 |
| 3.2.2 主要仪器和试剂 | 第53页 |
| 3.2.3 腈水解酶的制备 | 第53页 |
| 3.2.4 检测方法的建立及酶活单位的定义 | 第53-54页 |
| 3.2.5 pH对酶活的影响 | 第54页 |
| 3.2.6 温度对酶活的影响 | 第54页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第54-59页 |
| 3.3.1 腈水解酶底物特异性研究 | 第55页 |
| 3.3.2 反应温度对酶活的影响 | 第55-57页 |
| 3.3.3 最适催化pH | 第57-58页 |
| 3.3.4 金属离子与化学试剂对催化活力的影响 | 第58-59页 |
| 3.4 本章小结 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-62页 |
| 第四章 重组腈水解酶及突变体在生物法制备亚氨基二乙酸中的应用 | 第62-72页 |
| 4.1 引言 | 第62页 |
| 4.2 材料与方法 | 第62-64页 |
| 4.2.1 菌种与培养基 | 第62页 |
| 4.2.2 主要仪器和试剂 | 第62-63页 |
| 4.2.3 腈水解酶的制备 | 第63页 |
| 4.2.4 检测方法的建立,酶活单位的定义 | 第63页 |
| 4.2.5 细胞破碎以及游离酶的获得 | 第63页 |
| 4.2.6 AcfN腈水解酶及突变蛋白的分离纯化 | 第63页 |
| 4.2.7 粗酶液总蛋白含量的测定 | 第63页 |
| 4.2.8 催化亚氨基二乙腈产亚氨基二乙酸的反应进程研究 | 第63-64页 |
| 4.2.9 腈水解酶突变菌株的构建 | 第64页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第64-70页 |
| 4.3.1 亚氨基二乙酸的标准曲线 | 第64-65页 |
| 4.3.2 不同腈水解酶对亚氨基二乙腈的活力比较 | 第65页 |
| 4.3.3 AcfN的分离纯化 | 第65-66页 |
| 4.3.4 产亚氨基二乙酸的反应进程 | 第66-68页 |
| 4.3.5 AcfN腈水解酶突变蛋白的活力测定 | 第68-69页 |
| 4.3.6 AcfN腈水解酶结构分析 | 第69-70页 |
| 4.4 本章小结 | 第70页 |
| 参考文献 | 第70-72页 |
| 第五章 结论与展望 | 第72-74页 |
| 5.1 结论 | 第72-73页 |
| 5.2 展望 | 第73-74页 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文情况 | 第74-75页 |
| 致谢 | 第75页 |
