| 摘要 | 第7-9页 |
| ABSTRACT | 第9-10页 |
| 符号与缩略语说明 | 第11-12页 |
| 前言 | 第12-13页 |
| 文献综述 | 第13-35页 |
| 1 脱卤酶简介 | 第13-18页 |
| 1.1 脱卤酶的起源 | 第13页 |
| 1.2 脱卤酶的分类 | 第13页 |
| 1.3 来源于微生物的水解脱氯酶与脱氯机制 | 第13-18页 |
| 2 金属-β-内酰胺酶研究进展 | 第18-25页 |
| 2.1 金属-β-内酰胺酶的分类 | 第19-20页 |
| 2.2 金属-β-内酰胺酶与金属活性中心 | 第20-22页 |
| 2.3 金属酶中金属中心的研究方法 | 第22-24页 |
| 2.4 百菌清水解脱氯酶(Chd)金属中心研究现状 | 第24-25页 |
| 3 酶的体外定向进化技术 | 第25-29页 |
| 3.1 易错PCR法 | 第25-26页 |
| 3.2 基因改组(DNA shuffling) | 第26页 |
| 3.3 交错延伸(StEP)法 | 第26-27页 |
| 3.4 热点突变 | 第27页 |
| 3.5 随机引物体外重组法 | 第27-29页 |
| 参考文献 | 第29-35页 |
| 实验部分 | 第35-69页 |
| 第一章 百菌清水解脱氯酶Chd金属催化活性中心的研究 | 第35-49页 |
| 1 材料与方法 | 第35-40页 |
| 1.1 菌株质粒、培养基与试剂 | 第35页 |
| 1.2 Chd的制备 | 第35-37页 |
| 1.3 SDS聚丙烯酸胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 | 第37页 |
| 1.4 Chd金属离子替代性研究 | 第37-38页 |
| 1.5 金属离子替代后酶的热稳定性与最适反应温度 | 第38页 |
| 1.6 金属离子替代后酶的酸碱稳定性与最适反应pH值 | 第38页 |
| 1.7 酶的动力学参数测定 | 第38页 |
| 1.8 Chd中金属含量测定 | 第38-39页 |
| 1.9 定点突变验证金属结合位点 | 第39-40页 |
| 2 结果与分析 | 第40-46页 |
| 2.1 质粒提取 | 第40-41页 |
| 2.2 Chd的SDS-PAGE分析 | 第41-42页 |
| 2.3 金属离子替代性研究 | 第42页 |
| 2.4 金属离子替代后酶的热稳定性与最适反应温度 | 第42-44页 |
| 2.5 金属离子替代后酶的酸碱稳定性与最适反应pH值 | 第44-45页 |
| 2.6 金属离子替代酶的动力学参数测定 | 第45页 |
| 2.7 Chd的双核催化活性中心确定 | 第45-46页 |
| 2.8 定点突变 | 第46页 |
| 3 讨论 | 第46-47页 |
| 参考文献 | 第47-49页 |
| 第二章 百菌清水解脱氯酶(Chd)的随机突变 | 第49-57页 |
| 1 材料与方法 | 第49-51页 |
| 1.1 菌株、质粒和试剂 | 第49页 |
| 1.2 菌株CTN-3的基因组DNA的提取 | 第49-50页 |
| 1.3 引物设计 | 第50页 |
| 1.4 易错PCR | 第50页 |
| 1.5 目的基因的酶切和载体pMD-18T的制备 | 第50-51页 |
| 1.6 外源片段与载体的酶连、转化 | 第51页 |
| 1.7 平板法筛选活力提高的Chd突变体 | 第51页 |
| 1.8 序列测定与分析 | 第51页 |
| 2 结果与分析 | 第51-55页 |
| 2.1 菌株CTN-3的总DNA提取 | 第51-52页 |
| 2.2 易错PCR | 第52-53页 |
| 2.3 目的基因和载体酶切回收 | 第53页 |
| 2.4 平板法检测突变体酶活力 | 第53-54页 |
| 2.5 突变子测序结果分析 | 第54-55页 |
| 3 讨论 | 第55-56页 |
| 参考文献 | 第56-57页 |
| 第三章 Chd的DNA shuffling进化 | 第57-69页 |
| 1 材料与方法 | 第57-60页 |
| 1.1 菌株、质粒与试剂 | 第57页 |
| 1.2 突变体质粒提取 | 第57页 |
| 1.3 DNA shuffling模板制备 | 第57页 |
| 1.4 DNaseI消化 | 第57-58页 |
| 1.5 DNA shuffling | 第58页 |
| 1.6 有引物扩增DNA shuffling产物、酶连和转化 | 第58-59页 |
| 1.7 序列测定与分析 | 第59页 |
| 1.8 突变体表达载体的构建 | 第59-60页 |
| 1.9 突变体酶的表达纯化 | 第60页 |
| 1.10 突变体酶活、动力学参数的测定与比较 | 第60页 |
| 2 结果与分析 | 第60-66页 |
| 2.1 突变体质粒提取 | 第60-61页 |
| 2.2 各突变体目的基因的PCR扩增 | 第61-62页 |
| 2.3 DNaseI酶切 | 第62-63页 |
| 2.4 DNA shuffling | 第63页 |
| 2.5 有引物PCR扩增 | 第63-64页 |
| 2.6 平板法筛选有益突变体 | 第64-65页 |
| 2.7 突变体测序分析 | 第65页 |
| 2.8 突变体表达载体的构建、酶的表达纯化 | 第65页 |
| 2.9 突变体酶活、动力学参数的测定与比较 | 第65-66页 |
| 3 讨论 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-69页 |
| 全文总结 | 第69-71页 |
| 本论文主要创新点 | 第71-73页 |
| 附录 文中所用培养基及试剂配方 | 第73-75页 |
| 攻读硕士学位期间发表或已接收的论文 | 第75-77页 |
| 致谢 | 第77页 |
