| 摘要 | 第9-10页 |
| ABSTRACT | 第10-11页 |
| 符号与缩略语说明 | 第12-13页 |
| 前言 | 第13-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-32页 |
| 1 土壤中磷的形态 | 第14-15页 |
| 1.1 土壤有机态磷 | 第14页 |
| 1.2 土壤无机态磷 | 第14-15页 |
| 2 磷的生物地球化学循环 | 第15-16页 |
| 3 溶磷微生物的研究进展 | 第16-17页 |
| 3.1 溶磷微生物的发现 | 第16页 |
| 3.2 溶磷微生物的种类 | 第16-17页 |
| 4 溶磷微生物的作用机制 | 第17-20页 |
| 4.1 无机磷化物的转化 | 第17-19页 |
| 4.2 有机磷化物的转化 | 第19-20页 |
| 5 溶磷微生物的分子生物学研究进展 | 第20-21页 |
| 5.1 促进有机酸分泌的基因 | 第20-21页 |
| 5.2 其他溶磷相关基因 | 第21页 |
| 6 全长cDNA文库的构建方法 | 第21-24页 |
| 6.1 几种全长cDNA文库构建方法 | 第22页 |
| 6.2 SMART法原理及技术流程 | 第22-23页 |
| 6.3 SMART法的应用 | 第23-24页 |
| 参考文献 | 第24-32页 |
| 第二章 溶磷黑曲霉H1的cDNA文库构建 | 第32-46页 |
| 1 材料与方法 | 第32-39页 |
| 1.1 材料 | 第32-35页 |
| 1.1.1 菌株和质粒 | 第32-33页 |
| 1.1.2 主要试剂 | 第33-34页 |
| 1.1.3 主要仪器及设备 | 第34页 |
| 1.1.4 培养基的配制 | 第34页 |
| 1.1.5 引物、接头和工具酶 | 第34-35页 |
| 1.2 实验方法 | 第35-39页 |
| 1.2.1 黑曲霉H1总RNA的提取 | 第35-36页 |
| 1.2.2 mRNA的纯化 | 第36页 |
| 1.2.3 cDNA单链的RT-PCR合成 | 第36页 |
| 1.2.4 cDNA双链的LD-PCR合成 | 第36-37页 |
| 1.2.5 PCR产物的蛋白酶K消化 | 第37页 |
| 1.2.6 cDNA的分级分离 | 第37页 |
| 1.2.7 EcoRI及XhoI修饰 | 第37-38页 |
| 1.2.8 dscDNA与载体pBluescriptⅡ SK的酶连 | 第38页 |
| 1.2.9 重组质粒的电转化 | 第38页 |
| 1.2.10 cDNA文库的鉴定 | 第38-39页 |
| 2 结果和分析 | 第39-42页 |
| 2.1 真菌H1 cDNA文库的构建原理 | 第39-42页 |
| 2.1.1 黑曲霉H1的总RNA提取 | 第39-40页 |
| 2.1.2 真菌H1 mRNA的纯化 | 第40页 |
| 2.1.3 真菌H1的dscDNA的合成 | 第40-41页 |
| 2.1.4 真菌H1的dscDNA的分级分离 | 第41页 |
| 2.1.5 重组质粒的构建及电转化 | 第41-42页 |
| 2.2 cDNA文库的鉴定 | 第42页 |
| 3 讨论 | 第42-44页 |
| 4 本章小结 | 第44页 |
| 参考文献 | 第44-46页 |
| 第三章 溶磷相关基因psgA和psgB的筛选 | 第46-56页 |
| 1 材料与方法 | 第46-48页 |
| 1.1 材料 | 第46-47页 |
| 1.1.1 菌株与载体 | 第46页 |
| 1.1.2 主要试剂及培养基 | 第46页 |
| 1.1.3 主要仪器 | 第46-47页 |
| 1.1.4 引物序列 | 第47页 |
| 1.2 实验方法 | 第47-48页 |
| 1.2.1 溶磷相关基因的初筛 | 第47页 |
| 1.2.2 溶磷相关基因的复筛 | 第47页 |
| 1.2.3 转化子在难溶磷固体培养基上的溶磷效果 | 第47页 |
| 1.2.4 转化子在难溶磷液体培养基中的溶磷效果 | 第47页 |
| 1.2.5 溶磷相关基因的序列比对和同源性分析 | 第47-48页 |
| 2 实验结果与分析 | 第48-52页 |
| 2.1 溶磷相关基因的筛选 | 第48-49页 |
| 2.2 转化子溶磷效果的初步验证 | 第49-50页 |
| 2.2.1 转化子在难溶磷固体培养基上的溶磷效果 | 第49页 |
| 2.2.2 转化子对难溶无机磷液体培养基pH的影响 | 第49-50页 |
| 2.2.3 转化子对难溶无机磷液体培养基可溶磷含量的影响 | 第50页 |
| 2.3 溶磷相关基因psgA和psgB的序列比对和同源性分析 | 第50-52页 |
| 2.3.1 H-54的序列分析 | 第51页 |
| 2.3.2 H-47的序列分析 | 第51-52页 |
| 3 讨论 | 第52页 |
| 4 本章小结 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-56页 |
| 第四章 溶磷相关基因psgA功能的初步鉴定及序列生物信息学分析 | 第56-70页 |
| 1 材料与方法 | 第56-58页 |
| 1.1 材料 | 第56-57页 |
| 1.1.1 菌株与载体 | 第56页 |
| 1.1.2 主要试剂及培养基 | 第56-57页 |
| 1.1.3 主要仪器 | 第57页 |
| 1.1.4 引物 | 第57页 |
| 1.1.5 分析软件 | 第57页 |
| 1.2 实验方法 | 第57-58页 |
| 1.2.1 转化子培养过程中溶液pH和可溶磷含量的变化 | 第57-58页 |
| 1.2.2 转化子H-54表达胞外产物分析 | 第58页 |
| 1.2.3 溶磷相关基因psgA的生物信息学分析 | 第58页 |
| 2 结果与分析 | 第58-66页 |
| 2.1 携带基因psgA转化子H-54对溶液pH值的影响 | 第59页 |
| 2.2 携带基因psgA转化子H-54对溶液可溶磷含量的影响 | 第59-61页 |
| 2.2.1 磷标准曲线的绘制 | 第59-60页 |
| 2.2.2 psgA对溶液可溶磷含量影响 | 第60-61页 |
| 2.3 转化子H-54胞外产物分析 | 第61页 |
| 2.4 溶磷相关基因psgA的生物信息学分析 | 第61-66页 |
| 2.4.1 溶磷相关基因psgA开放阅读框分析 | 第61-62页 |
| 2.4.2 溶磷相关基因psgA表达的蛋白序列的同源性分析及功能预测 | 第62-64页 |
| 2.4.3 溶磷相关基因psgA表达蛋白的理化性质 | 第64页 |
| 2.4.4 ProtScale工具分析蛋白质的疏水性 | 第64-65页 |
| 2.4.5 HNN法预测蛋白质的二级结构 | 第65页 |
| 2.4.6 CPH及Swiss-pdbviewer软件预测蛋白质的三级结构 | 第65-66页 |
| 3 本章小结 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-70页 |
| 第五章 溶磷相关基因psgB功能的初步研究及生物信息学分析 | 第70-86页 |
| 1 材料与方法 | 第70-75页 |
| 1.1 材料 | 第70-72页 |
| 1.1.1 菌株与载体 | 第70-71页 |
| 1.1.2 基因 | 第71页 |
| 1.1.3 主要培养基、试剂及工具酶 | 第71-72页 |
| 1.1.4 主要仪器 | 第72页 |
| 1.1.5 分析软件 | 第72页 |
| 1.2 实验方法 | 第72-75页 |
| 1.2.1 基因psgB的开放阅读框分析 | 第72页 |
| 1.2.2 引物设计 | 第72-73页 |
| 1.2.3 基因psgB序列的扩增 | 第73页 |
| 1.2.4 cDNA片段的双酶切及产物回收 | 第73-74页 |
| 1.2.5 表达载体pGEX-B的构建 | 第74页 |
| 1.2.6 转化大肠杆菌DH5α | 第74页 |
| 1.2.7 菌落PCR验证 | 第74页 |
| 1.2.8 基因psgB对溶液pH值及可溶磷含量的影响 | 第74页 |
| 1.2.9 基因psgB对溶液中有机酸产生的影响 | 第74页 |
| 1.2.10 溶磷相关基因psgB表达蛋白的结构与功能预测 | 第74-75页 |
| 2 结果与分析 | 第75-84页 |
| 2.1 溶磷相关基因psgB的开放阅读框分析 | 第75页 |
| 2.2 表达载体的构建 | 第75-76页 |
| 2.2.1 基因psgB的PCR结果 | 第75-76页 |
| 2.2.2 菌落PCR验证 | 第76页 |
| 2.3 阳性转化子对溶液pH值及可溶磷含量的影响 | 第76-78页 |
| 2.3.1 磷标准曲线的绘制 | 第76-77页 |
| 2.3.2 psgB对溶液pH值及可溶磷含量的影响 | 第77-78页 |
| 2.4 阳性转化子的胞外产物分析 | 第78-79页 |
| 2.5 溶磷相关基因psgB表达的氨基酸结构与功能预测 | 第79-84页 |
| 2.5.1 基因psgB编码蛋白的同源性分析及功能预测 | 第79-81页 |
| 2.5.2 溶磷相关基因psgB表达蛋白的理化性质 | 第81-82页 |
| 2.5.3 ProtScale工具分析蛋白质的疏水性 | 第82页 |
| 2.5.4 蛋白保守结构域的分析 | 第82-83页 |
| 2.5.5 HNN法预测蛋白质的二级结构 | 第83页 |
| 2.5.6 CPH及Swiss-pdbviewer软件预测蛋白质的三级结构 | 第83-84页 |
| 3 本章小结 | 第84-85页 |
| 参考文献 | 第85-86页 |
| 全文总结 | 第86-88页 |
| 本文的创新点 | 第88-90页 |
| 附录 | 第90-92页 |
| 攻读硕士学位期间发表或已接收的学术论文 | 第92-94页 |
| 致谢 | 第94页 |
