| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 中英文缩写对照表 | 第17-18页 |
| 第一章 绪论 | 第18-45页 |
| 1.1 脂肪酶 | 第18-25页 |
| 1.1.1 脂肪酶简介 | 第18-22页 |
| 1.1.1.1 脂肪酶的定义 | 第18页 |
| 1.1.1.2 脂肪酶的来源 | 第18-19页 |
| 1.1.1.3 脂肪酶家族分类 | 第19-22页 |
| 1.1.2 脂肪酶的结构与催化机理 | 第22-24页 |
| 1.1.2.1 脂肪酶的结构特征 | 第22-23页 |
| 1.1.2.2 脂肪酶的催化机理 | 第23-24页 |
| 1.1.3 微生物脂肪酶的应用 | 第24-25页 |
| 1.1.3.1 在食品加工中的应用 | 第24页 |
| 1.1.3.2 在医药化学品制备中的应用 | 第24页 |
| 1.1.3.3 在化工技术中的应用 | 第24-25页 |
| 1.1.3.4 在环境治理中的应用 | 第25页 |
| 1.2 耐有机溶剂脂肪酶 | 第25-30页 |
| 1.2.1 耐有机溶剂脂肪酶简介 | 第25-26页 |
| 1.2.2 耐有机溶剂脂肪酶在非水相介质中的催化特征 | 第26-27页 |
| 1.2.2.1 影响脂肪酶在非水相介质中催化的主要因素 | 第26-27页 |
| 1.2.2.2 脂肪酶在非水相中催化的优点 | 第27页 |
| 1.2.3 获得耐有机溶剂脂肪酶的方法 | 第27-30页 |
| 1.2.3.1 筛选天然的耐有机溶剂脂肪酶 | 第28-29页 |
| 1.2.3.2 脂肪酶对有机溶剂耐受性的改造 | 第29-30页 |
| 1.3 酶蛋白结构的稳定性与改造 | 第30-36页 |
| 1.3.1 蛋白质结构的稳定机制 | 第30-34页 |
| 1.3.1.1 氢键 | 第30-31页 |
| 1.3.1.2 盐桥 | 第31-32页 |
| 1.3.1.3 疏水作用 | 第32页 |
| 1.3.1.4 包装效应 | 第32页 |
| 1.3.1.5 Loop区 | 第32-33页 |
| 1.3.1.6 其他效应 | 第33-34页 |
| 1.3.2 蛋白质结构稳定性的研究手段 | 第34-36页 |
| 1.3.2.1 分子生物学手段 | 第34页 |
| 1.3.2.2 结构生物学手段 | 第34-35页 |
| 1.3.2.3 生物信息学手段 | 第35-36页 |
| 1.4 L-薄荷醇的制备 | 第36-44页 |
| 1.4.1 天然提取方法 | 第37页 |
| 1.4.2 化学合成方法 | 第37-39页 |
| 1.4.2.1 从天然手性化合物合成 | 第37-38页 |
| 1.4.2.2 从人工化合物合成 | 第38-39页 |
| 1.4.3 生物催化方法 | 第39-44页 |
| 1.4.3.1 脂肪酶催化的酯化或转酯化方法 | 第40-43页 |
| 1.4.3.2 脂肪酶催化的水解方法 | 第43-44页 |
| 1.5 本课题的研究思路与主要内容 | 第44-45页 |
| 第二章 耐有机溶剂脂肪酶生产微生物的高通量筛选 | 第45-64页 |
| 2.1 引言 | 第45页 |
| 2.2 材料与方法 | 第45-53页 |
| 2.2.1 材料与试剂 | 第45-46页 |
| 2.2.2 主要仪器 | 第46页 |
| 2.2.3 培养基及培养条件 | 第46-48页 |
| 2.2.3.1 培养基 | 第46-47页 |
| 2.2.3.2 富含油脂土样的采集 | 第47页 |
| 2.2.3.3 微生物的培养条件 | 第47-48页 |
| 2.2.3.4 脂肪酶粉末的制备 | 第48页 |
| 2.2.4 耐有机溶剂脂肪酶生产菌的高通量筛选 | 第48页 |
| 2.2.4.1 产脂肪酶微生物的平板筛选 | 第48页 |
| 2.2.4.2 耐有机溶剂脂肪酶的高通量筛选 | 第48页 |
| 2.2.5 16S rDNA测序及菌种鉴定 | 第48-49页 |
| 2.2.6 不同有机溶剂对Bacillus subtilis ZJU003脂肪酶与Xanthomonasoryzae ZJU548脂肪酶活力的影响 | 第49页 |
| 2.2.7 双液相中脂肪酶水解活力测量精度的验证 | 第49页 |
| 2.2.8 有机溶剂中4对薄荷醇异构体混合物的脂肪酶拆分 | 第49-50页 |
| 2.2.9 分析方法 | 第50-53页 |
| 2.2.9.1 双液相荧光分析方法 | 第50页 |
| 2.2.9.2 比色分析方法 | 第50-51页 |
| 2.2.9.3 气相色谱分析方法 | 第51-53页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第53-63页 |
| 2.3.1 高通量筛选方法的建立 | 第53-54页 |
| 2.3.1.1 双液相荧光方法测量精度的验证 | 第53页 |
| 2.3.1.2 双液相荧光方法的检测速度与检测下限 | 第53-54页 |
| 2.3.2 耐有机溶剂脂肪酶生产微生物的高通量筛选 | 第54-55页 |
| 2.3.3 产耐有机溶剂脂肪酶微生物在20%(v/v)甲苯中的生长情况 | 第55-58页 |
| 2.3.4 不同有机溶剂对脂肪酶活力的影响 | 第58-61页 |
| 2.3.5 非对映体选择性拆分4对薄荷醇脂肪酶的筛选 | 第61-63页 |
| 2.4 小结 | 第63-64页 |
| 第三章 Stenotrophomonas maltophilia CGMCC4254脂肪酶的研究 | 第64-93页 |
| 3.1 引言 | 第64页 |
| 3.2 材料与方法 | 第64-70页 |
| 3.2.1 材料与试剂 | 第64-65页 |
| 3.2.2 主要仪器 | 第65页 |
| 3.2.3 培养基及培养条件 | 第65-66页 |
| 3.2.3.1 培养基 | 第65-66页 |
| 3.2.3.2 培养条件 | 第66页 |
| 3.2.3.3 培养基优化过程 | 第66页 |
| 3.2.4 微生物生理生化鉴定 | 第66页 |
| 3.2.5 胞外脂肪酶的纯化 | 第66-67页 |
| 3.2.5.1 脂肪酶的部分纯化 | 第66-67页 |
| 3.2.5.2 脂肪酶样品中蛋白质纯度的检测 | 第67页 |
| 3.2.6 脂肪酶酶学性质研究 | 第67-69页 |
| 3.2.6.1 底物特异性 | 第67页 |
| 3.2.6.2 pH对脂肪酶活力的影响 | 第67-68页 |
| 3.2.6.3 温度对脂肪酶活力的影响 | 第68页 |
| 3.2.6.4 金属离子及表面活性剂对脂肪酶活力的影响 | 第68页 |
| 3.2.6.5 脂肪酶在有机溶剂中的稳定性 | 第68页 |
| 3.2.6.6 脂肪酶催化的甘油酯化反应 | 第68-69页 |
| 3.2.7 有机溶剂中拆分4对薄荷醇混合物 | 第69页 |
| 3.2.8 分析方法 | 第69-70页 |
| 3.2.8.1 酸度滴定法 | 第69页 |
| 3.2.8.2 气相色谱分析 | 第69页 |
| 3.2.8.3 蛋白质浓度测定 | 第69-70页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第70-91页 |
| 3.3.1 耐有机溶剂脂肪酶生产菌CGMCC4254的菌种鉴定 | 第70-72页 |
| 3.3.1.1 16S rDNA进化树分析 | 第70页 |
| 3.3.1.2 菌株CGMCC4254的形态与生理生化特征 | 第70-72页 |
| 3.3.2 S.maltophilia CGMCC4254产脂肪酶条件的研究 | 第72-82页 |
| 3.3.2.1 发酵条件对微生物产脂肪酶的影响 | 第72-74页 |
| 3.3.2.2 培养基组分对S.maltophilia CGMCC4254产脂肪酶的影响 | 第74-77页 |
| 3.3.2.3 影响微生物产脂肪酶的显著性因素检验 | 第77-78页 |
| 3.3.2.4 响应面法优化发酵培养基的组分浓度 | 第78-82页 |
| 3.3.2.5 培养基优化过程小结 | 第82页 |
| 3.3.3 胞外脂肪酶的纯化 | 第82-84页 |
| 3.3.4 S.maltophilia CGMCC4254脂肪酶的酶学性质研究 | 第84-90页 |
| 3.3.4.1 脂肪酶的底物特异性 | 第84-85页 |
| 3.3.4.2 pH对脂肪酶活力的影响 | 第85-86页 |
| 3.3.4.3 温度对脂肪酶活力的影响 | 第86-87页 |
| 3.3.4.4 金属离子与表面活性剂对脂肪酶活力的影响 | 第87-88页 |
| 3.3.4.5 脂肪酶在有机溶剂中的稳定性 | 第88-90页 |
| 3.3.5 有机溶剂中拆分4对薄荷醇 | 第90-91页 |
| 3.4 小结 | 第91-93页 |
| 第四章 S.maltophilia脂肪酶基因克隆与异源表达体系的研究 | 第93-124页 |
| 4.1 引言 | 第93-94页 |
| 4.2 材料与方法 | 第94-100页 |
| 4.2.1 基因工程试剂(盒)与遗传信息学分析工具 | 第94-95页 |
| 4.2.2 菌株与质粒 | 第95页 |
| 4.2.3 培养基与培养条件 | 第95-96页 |
| 4.2.3.1 大肠杆菌培养基与培养条件 | 第95-96页 |
| 4.2.3.2 毕赤酵母表达系统培养基 | 第96页 |
| 4.2.4 S.maltophilia CGMCC4254基因组文库的构建 | 第96页 |
| 4.2.5 LipSM54在重组大肠杆菌中的表达 | 第96-98页 |
| 4.2.5.1 重组E.coli BL21(DE3)- pET30a(+)-LipSM54的构建 | 第96页 |
| 4.2.5.2 LipSM54在重组大肠杆菌中的表达与纯化 | 第96-97页 |
| 4.2.5.3 LipSM54的酶学性质研究 | 第97页 |
| 4.2.5.4 LipSM54突变体的构建与蛋白质表达 | 第97-98页 |
| 4.2.6 脂肪酶在Pichia pastoris中的表达 | 第98-99页 |
| 4.2.6.1 重组pPIC9K-LipSM54质粒的构建 | 第98页 |
| 4.2.6.2 重组P pastoris -pPIC9K-LipSM54表达系统的构建 | 第98-99页 |
| 4.2.6.3 重组脂肪酶的表达 | 第99页 |
| 4.2.7 LipSM54的同源模建与分子对接 | 第99-100页 |
| 4.2.8 分析方法 | 第100页 |
| 4.2.8.1 比色分析方法(见2.2.9.2) | 第100页 |
| 4.2.8.2 酸度滴定法(见3.2.8.1) | 第100页 |
| 4.2.8.3 气相色谱分析(见2.2.9.3) | 第100页 |
| 4.2.8.4 蛋白质浓度测定(见3.2.8.4) | 第100页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第100-123页 |
| 4.3.1 LipSM54基因的克隆 | 第100页 |
| 4.3.2 新细菌脂肪酶家族(LipSM54家族)的发现与建立 | 第100-109页 |
| 4.3.2.1 LipSM54氨基酸序列及同源性脂肪酶的进化树分析 | 第100-102页 |
| 4.3.2.2 LipSM54家族中保守氨基酸序列的比对 | 第102-103页 |
| 4.3.2.3 新细菌脂肪酶氧离子洞 | 第103-107页 |
| 4.3.2.4 X.oryzae脂肪酶的克隆、表达与脂肪酶性质研究 | 第107-109页 |
| 4.3.3 LipSM54在重组大肠杆菌中的表达 | 第109-116页 |
| 4.3.3.1 LipSM54的表达与纯化 | 第109-111页 |
| 4.3.3.2 LipSM54酶学性质的研究 | 第111-115页 |
| 4.3.3.3 LipSM54在有机溶剂中拆分4对薄荷醇 | 第115-116页 |
| 4.3.3.4 LipSM54与SML酶学性质的比较 | 第116页 |
| 4.3.4 LipSM54在重组毕赤酵母中的表达 | 第116-119页 |
| 4.3.4.1 重组P.pastoris -pPIC9K-LipSM54表达体系的构建 | 第117-118页 |
| 4.3.4.2 LipSM54在重组GS115-pPIC9K-LipSM54中的诱导表达 | 第118页 |
| 4.3.4.3 重组酵母中表达的LipSM54拆分4对薄荷醇 | 第118-119页 |
| 4.3.5 重组大肠杆菌脂肪酶的表达条件优化 | 第119-123页 |
| 4.3.5.1 诱导时机对重组大肠杆菌产脂肪酶的影响 | 第119-120页 |
| 4.3.5.2 诱导温度对重组脂肪酶发酵活力的影响 | 第120-121页 |
| 4.3.5.3 IPTG浓度对重组大肠杆菌产脂肪酶的影响 | 第121页 |
| 4.3.5.4 诱导时间对重组大肠杆菌脂肪酶表达量的影响 | 第121-123页 |
| 4.4 小结 | 第123-124页 |
| 第五章 提高脂肪酶热稳定性的蛋白质结构设计 | 第124-143页 |
| 5.1 引言 | 第124页 |
| 5.2 材料与方法 | 第124-126页 |
| 5.2.1 蛋白质分子模拟软件及在线数据库 | 第124-125页 |
| 5.2.1.1 蛋白质分子模拟软件 | 第124页 |
| 5.2.1.2 蛋白质结构在线数据库 | 第124-125页 |
| 5.2.2 热稳定性突变体的虚拟文库构建与筛选 | 第125页 |
| 5.2.3 分子动力学计算 | 第125页 |
| 5.2.4 突变体的构建与表达 | 第125页 |
| 5.2.5 双突变脂肪酶的酶学性质 | 第125页 |
| 5.2.6 分析方法 | 第125-126页 |
| 5.2.6.1 比色分析方法(见2.2.9.2) | 第125页 |
| 5.2.6.2 酸度滴定法(见3.2.8.1) | 第125页 |
| 5.2.6.3 气相色谱分析(见2.2.9.3) | 第125页 |
| 5.2.6.4 蛋白质浓度测定(见3.2.8.4) | 第125-126页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第126-142页 |
| 5.3.1 LipSM54结构柔性的研究 | 第126-129页 |
| 5.3.1.1 脂肪酶分子热变性的沉聚实验 | 第126页 |
| 5.3.1.2 LipSM54空间结构中柔性区域的分析 | 第126-129页 |
| 5.3.2 热稳定性双突变体的虚拟文库构建与筛选 | 第129-132页 |
| 5.3.2.1 虚拟靶点的数据采集 | 第129-130页 |
| 5.3.2.2 虚拟双突变文库的构建 | 第130页 |
| 5.3.2.3 虚拟突变文库的筛选 | 第130-131页 |
| 5.3.2.4 双突变脂肪酶的构建与热稳定性 | 第131-132页 |
| 5.3.3 温度对F73R-G165D突变脂肪酶活力的影响 | 第132-136页 |
| 5.3.3.1 脂肪酶在不同温度下的热稳定性 | 第132-133页 |
| 5.3.3.2 脂肪酶在50oC下的半衰期 | 第133-134页 |
| 5.3.3.3 脂肪酶在不同温度下的催化活力 | 第134-135页 |
| 5.3.3.4 脂肪酶在有机溶剂中的稳定性 | 第135-136页 |
| 5.3.3.5 M-LipSM54在非水相中拆分4对薄荷醇 | 第136页 |
| 5.3.4 脂肪酶热稳定性的蛋白质结构研究 | 第136-142页 |
| 5.3.4.1 脂肪酶热稳定性结构的热力学研究 | 第136-139页 |
| 5.3.4.2 脂肪酶热稳定性结构的分子动力学研究 | 第139-142页 |
| 5.4 小结 | 第142-143页 |
| 第六章 重组脂肪酶非水相中拆分4对薄荷醇混合物的研究 | 第143-155页 |
| 6.1 引言 | 第143页 |
| 6.2 材料与方法 | 第143-146页 |
| 6.2.1 试剂与仪器 | 第143-144页 |
| 6.2.2 菌种及培养基 | 第144页 |
| 6.2.3 重组LipSM54的制备 | 第144页 |
| 6.2.4 脂肪酶催化4对薄荷醇拆分 | 第144页 |
| 6.2.5 1L规模的酶促转酯化反应 | 第144页 |
| 6.2.6 重组脂肪酶催化的其他手性醇与手性胺拆分 | 第144-145页 |
| 6.2.7 分析方法 | 第145-146页 |
| 6.2.7.1 产物苯乙胺乙酸酯的高效液相色谱分析 | 第145页 |
| 6.2.7.2 手性醇的气相色谱分析方法 | 第145-146页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第146-153页 |
| 6.3.1 脂肪酶催化的薄荷醇拆分工艺研究 | 第146-149页 |
| 6.3.1.1 有机溶剂种类对酶促薄荷醇拆分的影响 | 第146-147页 |
| 6.3.1.2 酰基供体种类对薄荷醇拆分过程的影响 | 第147-148页 |
| 6.3.1.3 底物比例对薄荷醇拆分过程的影响 | 第148页 |
| 6.3.1.4 温度对薄荷醇拆分过程的影响 | 第148-149页 |
| 6.3.1.5 酶促拆分工艺优化小结 | 第149页 |
| 6.3.2 LipSM54与商业脂肪酶的比较 | 第149-151页 |
| 6.3.2.1 商业脂肪酶拆分4对薄荷醇的研究 | 第149-150页 |
| 6.3.2.2 高底物浓度拆分过程的研究 | 第150-151页 |
| 6.3.3 1 L反应体系的研究 | 第151-152页 |
| 6.3.4 其他重要手性醇(胺)的拆分 | 第152-153页 |
| 6.4 小结 | 第153-155页 |
| 第七章 总结与展望 | 第155-158页 |
| 7.1 全文总结 | 第155-156页 |
| 7.2 论文创新点 | 第156-157页 |
| 7.3 工作展望 | 第157-158页 |
| 参考文献 | 第158-173页 |
| 作者简历 | 第173-174页 |
| 附录 | 第174-186页 |
