| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-32页 |
| 1.1 靛蓝 | 第15-19页 |
| 1.1.1 靛蓝的性质 | 第15页 |
| 1.1.2 靛蓝的用途 | 第15页 |
| 1.1.3 靛蓝的制备方法 | 第15-19页 |
| 1.2 酶分子的体外改造 | 第19-22页 |
| 1.2.1 定向进化 | 第19-20页 |
| 1.2.2 半理性改造 | 第20-21页 |
| 1.2.3 理性设计 | 第21-22页 |
| 1.3 细胞色素P450 BM-3的研究 | 第22-31页 |
| 1.3.1 细胞色素P450酶系 | 第22页 |
| 1.3.2 P450 BM-3的结构及催化机制 | 第22-25页 |
| 1.3.3 结构与功能研究 | 第25-29页 |
| 1.3.4 面向靛蓝生产的P450酶的分子改造 | 第29-31页 |
| 1.4 课题的研究目标及内容 | 第31-32页 |
| 1.4.1 研究目标 | 第31页 |
| 1.4.2 技术路线图 | 第31页 |
| 1.4.3 研究内容 | 第31-32页 |
| 第二章 初筛培养基的改进及乳糖促进P450 BM-3可溶性表达的研究 | 第32-44页 |
| 2.1 引言 | 第32-33页 |
| 2.2 实验材料 | 第33-35页 |
| 2.2.1 菌种与质粒 | 第33-34页 |
| 2.2.2 试剂 | 第34页 |
| 2.2.3 培养基 | 第34页 |
| 2.2.4 主要仪器设备 | 第34-35页 |
| 2.3 实验方法 | 第35-37页 |
| 2.3.1 大肠杆菌感受态细胞制备 | 第35页 |
| 2.3.2 质粒的转化 | 第35页 |
| 2.3.3 IPTG诱导P450 BM-3表达条件 | 第35页 |
| 2.3.4 乳糖诱导P450 BM-3表达条件的优化 | 第35-36页 |
| 2.3.5 初筛方法的改进 | 第36页 |
| 2.3.6 P450 BM-3粗酶液的制备及纯化 | 第36页 |
| 2.3.7 P450 BM-3浓度测定 | 第36页 |
| 2.3.8 蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第36-37页 |
| 2.3.9 摇瓶中乳糖与IPTG诱导效果的比较 | 第37页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第37-43页 |
| 2.4.1 乳糖最佳诱导条件的确定 | 第37-39页 |
| 2.4.2 初筛方法的改进结果 | 第39-41页 |
| 2.4.3 摇瓶培养中乳糖与IPTG诱导情况的比较 | 第41-43页 |
| 2.5 本章小结 | 第43-44页 |
| 第三章 P450 BM-3的168/435位点突变组合文库的构建及筛选 | 第44-60页 |
| 3.1 引言 | 第44-45页 |
| 3.2 实验材料 | 第45-46页 |
| 3.2.1 菌种与质粒 | 第45页 |
| 3.2.2 试剂 | 第45页 |
| 3.2.3 培养基 | 第45页 |
| 3.2.4 主要仪器设备 | 第45页 |
| 3.2.5 DNA测序及引物合成 | 第45-46页 |
| 3.3 实验方法 | 第46-51页 |
| 3.3.1 质粒提取 | 第46页 |
| 3.3.2 感受态细胞制备 | 第46页 |
| 3.3.3 突变文库的构建 | 第46-49页 |
| 3.3.4 突变文库的筛选 | 第49-50页 |
| 3.3.5 突变酶表达与纯化 | 第50页 |
| 3.3.6 突变酶浓度测定 | 第50页 |
| 3.3.7 突变酶比活力测定 | 第50页 |
| 3.3.8 突变酶动力学参数测定 | 第50页 |
| 3.3.9 突变酶电子耦合率测定 | 第50-51页 |
| 3.3.10 突变酶区域选择性的测定 | 第51页 |
| 3.3.11 突变酶三维结构模建 | 第51页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第51-59页 |
| 3.4.1 D168L/E435T定点突变结果分析 | 第51-52页 |
| 3.4.2 大引物法双突变组合的饱和文库的构建与筛选 | 第52-53页 |
| 3.4.3 突变酶催化性能分析 | 第53-54页 |
| 3.4.4 突变酶的动力学参数分析 | 第54-55页 |
| 3.4.5 电子耦合率分析 | 第55-56页 |
| 3.4.6 区域选择性分析 | 第56-58页 |
| 3.4.7 突变酶168位点与435位点协同效应分析 | 第58-59页 |
| 3.5 本章小结 | 第59-60页 |
| 第四章 易错文库的构建及筛选 | 第60-71页 |
| 4.1 引言 | 第60页 |
| 4.2 实验材料 | 第60-61页 |
| 4.2.1 菌种与质粒 | 第60页 |
| 4.2.2 试剂 | 第60页 |
| 4.2.3 培养基 | 第60-61页 |
| 4.2.4 主要仪器设备 | 第61页 |
| 4.2.5 DNA测序及引物合成 | 第61页 |
| 4.3 实验方法 | 第61-64页 |
| 4.3.1 质粒提取 | 第61页 |
| 4.3.2 感受态细胞制备 | 第61页 |
| 4.3.3 血红素域易错文库的构建与筛选 | 第61-63页 |
| 4.3.4 V445饱和突变文库的构建与筛选 | 第63页 |
| 4.3.5 突变酶表达与纯化 | 第63页 |
| 4.3.6 突变酶浓度测定 | 第63页 |
| 4.3.7 突变酶比活力测定 | 第63页 |
| 4.3.8 突变酶动力学参数测定 | 第63-64页 |
| 4.3.9 突变酶电子耦合率测定 | 第64页 |
| 4.3.10 突变酶区域选择性测定 | 第64页 |
| 4.3.11 突变酶三维结构模建 | 第64页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第64-70页 |
| 4.4.1 易错文库PCR体系中Mn~(2+)浓度优化 | 第64-66页 |
| 4.4.2 易错文库的筛选结果与讨论 | 第66页 |
| 4.4.3 V445位点的饱和突变 | 第66-68页 |
| 4.4.4 突变酶V445A的诱导表达结果 | 第68页 |
| 4.4.5 突变酶催化性能分析 | 第68-69页 |
| 4.4.6 电子耦合率与区域选择性 | 第69页 |
| 4.4.7 突变酶V445A结构与功能分析 | 第69-70页 |
| 4.5 本章小结 | 第70-71页 |
| 第五章 突变酶D168L/E435T/V445A的酶学性质研究 | 第71-78页 |
| 5.1 引言 | 第71页 |
| 5.2 实验材料 | 第71-72页 |
| 5.2.1 菌种与质粒 | 第71页 |
| 5.2.2 试剂 | 第71页 |
| 5.2.3 培养基 | 第71页 |
| 5.2.4 主要仪器设备 | 第71页 |
| 5.2.5 DNA测序及引物合成 | 第71-72页 |
| 5.3 实验方法 | 第72-73页 |
| 5.3.1 质粒提取 | 第72页 |
| 5.3.2 感受态细胞制备 | 第72页 |
| 5.3.3 突变酶D168L/E435T/V445A的构建 | 第72页 |
| 5.3.4 突变酶表达与纯化 | 第72页 |
| 5.3.5 突变酶浓度测定 | 第72页 |
| 5.3.6 突变酶比活力测定 | 第72页 |
| 5.3.7 突变酶动力学参数测定 | 第72页 |
| 5.3.8 突变酶电子耦合率测定 | 第72页 |
| 5.3.9 突变酶区域选择性测定 | 第72-73页 |
| 5.3.10 突变酶三维结构模建 | 第73页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第73-77页 |
| 5.4.1 定点突变结果分析 | 第73页 |
| 5.4.2 突变酶催化性能分析 | 第73-74页 |
| 5.4.3 突变酶动力学参数分析 | 第74-75页 |
| 5.4.4 突变酶电子耦合效率的分析 | 第75页 |
| 5.4.5 突变酶催化吲哚区域选择性的分析 | 第75-76页 |
| 5.4.6 突变酶D168L/E435T/V445A结构与功能分析 | 第76-77页 |
| 5.5 本章小结 | 第77-78页 |
| 第六章 结论与展望 | 第78-82页 |
| 6.1 总结 | 第78-79页 |
| 6.2 展望 | 第79-82页 |
| 参考文献 | 第82-95页 |
| 攻读博士学位期间的科研成果 | 第95页 |
