| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 缩略表(Abbreviation) | 第13-15页 |
| 第一章 前言 | 第15-23页 |
| 1 小反刍兽疫的流行病学 | 第15-16页 |
| 2 小反刍兽疫病毒的分子生物学特性 | 第16-19页 |
| 2.1 小反刍兽疫病毒的形态结构 | 第16页 |
| 2.2 小反刍兽疫病毒基因组的结构与功能 | 第16-18页 |
| 2.3 小反刍兽疫病毒的理化性质 | 第18页 |
| 2.4 小反刍兽疫病毒的复制过程 | 第18-19页 |
| 3 小反刍兽疫的临床表现和病理变化 | 第19-20页 |
| 4 小反刍兽疫的诊断 | 第20-21页 |
| 5 小反刍兽疫的防控及疫苗研究现状 | 第21-22页 |
| 5.1 传统疫苗 | 第21页 |
| 5.2 新型疫苗的发展 | 第21-22页 |
| 6 研究目的与意义 | 第22-23页 |
| 第二章 材料与方法 | 第23-50页 |
| 2.1 实验材料 | 第23-28页 |
| 2.1.1 质粒、菌株、病毒、细胞系、血清、试剂盒和实验动物 | 第23页 |
| 2.1.2 主要药品、试剂和仪器 | 第23-24页 |
| 2.1.3 主要培养基及其配制 | 第24-25页 |
| 2.1.4 主要缓冲液（溶液）及其配制 | 第25-28页 |
| 2.2 实验方法 | 第28-50页 |
| 2.2.1 PPRV N蛋白原核表达质粒的构建及单克隆抗体的制备 | 第28-40页 |
| 2.2.1.1 病毒扩增 | 第28页 |
| 2.2.1.2 N基因引物的设计 | 第28页 |
| 2.2.1.3 病毒总RNA的提取 | 第28-29页 |
| 2.2.1.4 N基因的扩增 | 第29-30页 |
| 2.2.1.5 DNA片段的回收纯化 | 第30页 |
| 2.2.1.6 限制性内切酶反应 | 第30页 |
| 2.2.1.7 连接反应 | 第30-31页 |
| 2.2.1.8 连接产物的转化 | 第31页 |
| 2.2.1.9 重组质粒的提取 | 第31页 |
| 2.2.1.10 重组质粒的鉴定 | 第31页 |
| 2.2.1.11 pET-28a-PPRV-N的诱导表达 | 第31-32页 |
| 2.2.1.12 重组蛋白可溶性分析 | 第32页 |
| 2.2.1.13 表达产物pET-28a-PPRV-N的SDS-PAGE分析 | 第32页 |
| 2.2.1.14 表达产物pET-28a-PPRV-N的Western Blot分析 | 第32页 |
| 2.2.1.15 pET-28a-PPRV-N蛋白的纯化及定量 | 第32-33页 |
| 2.2.1.16 动物免疫 | 第33-34页 |
| 2.2.1.17 间接ELISA检测方法的建立 | 第34页 |
| 2.2.1.18 间接ELISA法检测小鼠的免疫效价 | 第34-35页 |
| 2.2.1.19 SP2/0 骨髓瘤细胞的准备 | 第35页 |
| 2.2.1.20 免疫脾细胞的制备 | 第35页 |
| 2.2.1.21 饲养细胞的制备 | 第35-36页 |
| 2.2.1.22 细胞融合 | 第36页 |
| 2.2.1.23 阳性杂交瘤细胞的筛选 | 第36页 |
| 2.2.1.24 阳性杂交瘤细胞的亚克隆 | 第36-37页 |
| 2.2.1.25 杂交瘤细胞的染色体计数 | 第37页 |
| 2.2.1.26 单克隆抗体的大量制备 | 第37页 |
| 2.2.1.27 单克隆抗体效价的检测 | 第37-38页 |
| 2.2.1.28 单克隆抗体的亚型鉴定 | 第38页 |
| 2.2.1.29 单克隆抗体的IFA分析 | 第38页 |
| 2.2.1.30 单克隆抗体的Western Blot分析 | 第38页 |
| 2.2.1.31 单克隆抗体靶抗原表位区域的分析 | 第38-39页 |
| 2.2.1.32 小片段的原核表达 | 第39页 |
| 2.2.1.33 单克隆抗体靶抗原表位的初步判定 | 第39-40页 |
| 2.2.1.34 单克隆抗体阻断活性分析 | 第40页 |
| 2.2.2 PPRV N蛋白杆状病毒表达质粒的构建及鉴定 | 第40-45页 |
| 2.2.2.1 N基因和M13引物的设计 | 第40-41页 |
| 2.2.2.2 PPRV-bac-N基因的扩增 | 第41页 |
| 2.2.2.3 DNA片段的回收纯化 | 第41页 |
| 2.2.2.4 限制性内切酶反应 | 第41页 |
| 2.2.2.5 连接反应 | 第41页 |
| 2.2.2.6 连接产物的转化 | 第41-42页 |
| 2.2.2.7 重组质粒的提取 | 第42页 |
| 2.2.2.8 重组质粒的鉴定 | 第42页 |
| 2.2.2.9 重组穿梭质粒的构建 | 第42页 |
| 2.2.2.10 重组穿梭质粒的提取 | 第42-43页 |
| 2.2.2.11 重组穿梭质粒的鉴定 | 第43页 |
| 2.2.2.12 重组杆状病毒Bacmid-PPRV-N的获得 | 第43-44页 |
| 2.2.2.13 重组杆状病毒Bacmid-PPRV-N的扩增 | 第44页 |
| 2.2.2.14 重组蛋白Bacmid-PPRV-N的IFA分析 | 第44页 |
| 2.2.2.15 重组蛋白Bacmid-PPRV-N的Western Blot分析 | 第44页 |
| 2.2.2.16 重组蛋白Bacmid-PPRV-N的表达特性 | 第44-45页 |
| 2.2.2.17 重组蛋白Bacmid-PPRV-N与N蛋白单克隆抗体亲和力的检测 | 第45页 |
| 2.2.3 PPRV阻断ELISA抗体检测试剂盒的研制 | 第45-50页 |
| 2.2.3.1 腹水的纯化 | 第45页 |
| 2.2.3.2 纯化腹水的标记 | 第45-46页 |
| 2.2.3.3 标记抗体效价的分析 | 第46页 |
| 2.2.3.4 抗原最佳包被浓度及酶标抗体最佳稀释度的确定 | 第46页 |
| 2.2.3.5 封闭液的确定 | 第46-47页 |
| 2.2.3.6 样品稀释液的确定 | 第47页 |
| 2.2.3.7 血清最佳反应时间的确定 | 第47页 |
| 2.2.3.8 酶标二抗最佳反应时间的确定 | 第47页 |
| 2.2.3.9 底物最佳反应时间的确定 | 第47-48页 |
| 2.2.3.10 阻断ELISA的临界值 | 第48页 |
| 2.2.3.11 批内重复试验 | 第48页 |
| 2.2.3.12 批间重复试验 | 第48页 |
| 2.2.3.13 敏感性试验 | 第48页 |
| 2.2.3.14 特异性试验 | 第48页 |
| 2.2.3.15 符合率试验 | 第48-49页 |
| 2.2.3.16 保存期试验 | 第49页 |
| 2.2.3.17 统计学分析 | 第49-50页 |
| 第三章 结果与分析 | 第50-79页 |
| 3.1 PPRV N蛋白原核表达质粒的构建及单克隆抗体的制备 | 第50-60页 |
| 3.1.1 N基因片段PCR扩增及克隆质粒的鉴定 | 第50-51页 |
| 3.1.2 pET-28a-PPRV-N重组蛋白的表达及纯化 | 第51-53页 |
| 3.1.3 pET-28a-PPRV-N蛋白最佳抗原包被浓度的测定 | 第53页 |
| 3.1.4 小鼠免疫效价的检测 | 第53-54页 |
| 3.1.5 杂交瘤细胞株的筛选 | 第54页 |
| 3.1.6 杂交瘤细胞遗传稳定性的分析 | 第54-55页 |
| 3.1.7 单克隆抗体效价的检测 | 第55-56页 |
| 3.1.8 单克隆抗体亚型的鉴定 | 第56页 |
| 3.1.9 单克隆抗体的IFA检测 | 第56-57页 |
| 3.1.10 单克隆抗体的Western Blot分析 | 第57页 |
| 3.1.11 单克隆抗体的抗原表位的检测 | 第57-59页 |
| 3.1.11.1 小片段的原核表达分析 | 第57-58页 |
| 3.1.11.2 N蛋白抗原表位的区域分析 | 第58-59页 |
| 3.1.12 单克隆抗体阻断活性分析 | 第59-60页 |
| 3.2 PPRV N蛋白杆状病毒表达质粒的构建及鉴定 | 第60-65页 |
| 3.2.1 PPRV-bac-N基因片段PCR扩增及克隆质粒的鉴定 | 第60-61页 |
| 3.2.2 穿梭质粒bacmid-PPRV-N的鉴定 | 第61-62页 |
| 3.2.3 重组杆状病毒Bacmid-PPRV-N的获得 | 第62页 |
| 3.2.4 重组杆状病毒Bacmid-PPRV-N蛋白的IFA分析 | 第62-63页 |
| 3.2.5 重组杆状病毒Bacmid-PPRV-N蛋白的Western Blot分析 | 第63-65页 |
| 3.2.6 重组杆状病毒Bacmid-PPRV-N蛋白与N蛋白单克隆抗体亲和力的检测 | 第65页 |
| 3.3 PPRV阻断ELISA抗体检测试剂盒的研发 | 第65-76页 |
| 3.3.1 腹水的纯化 | 第65-66页 |
| 3.3.2 纯化腹水标记后效价测定 | 第66页 |
| 3.3.3 方阵滴定法测定抗原最佳包被浓度及酶标二抗最佳稀释倍数 | 第66-67页 |
| 3.3.4 最佳封闭液的确定 | 第67-68页 |
| 3.3.5 最佳样品稀释液的确定 | 第68页 |
| 3.3.6 血清最佳孵育时间的确定 | 第68-69页 |
| 3.3.7 酶标二抗最佳孵育时间的确定 | 第69-70页 |
| 3.3.8 底物最佳孵育时间的确定 | 第70页 |
| 3.3.9 临界值的确定 | 第70-71页 |
| 3.3.10 阻断ELISA的操作程序 | 第71页 |
| 3.3.11 PPRV阻断ELISA抗体检测方法的评价 | 第71-76页 |
| 3.3.11.1 批内重复性 | 第71-72页 |
| 3.3.11.2 批间重复性 | 第72-73页 |
| 3.3.11.3 敏感性试验 | 第73页 |
| 3.3.11.4 特异性试验 | 第73-74页 |
| 3.3.11.5 符合率试验 | 第74-75页 |
| 3.3.11.6 保存期试验 | 第75-76页 |
| 3.4 讨论 | 第76-79页 |
| 3.4.1 PPRV N蛋白原核表达质粒的构建及单克隆抗体的制备 | 第76-77页 |
| 3.4.2 PPRV N蛋白杆状病毒真核质粒的构建与鉴定 | 第77页 |
| 3.4.3 PPRV阻断ELISA抗体检测试剂盒的研发 | 第77-79页 |
| 第四章 结论 | 第79-80页 |
| 参考文献 | 第80-88页 |
| 致谢 | 第88页 |
