| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 绪论 | 第12-21页 |
| 1 核糖体简介 | 第12-14页 |
| 1.1 核糖体的组成 | 第12页 |
| 1.2 核糖体的转录 | 第12页 |
| 1.3 核糖体蛋白基因的表达及调控 | 第12-13页 |
| 1.4 核糖体蛋白的功能 | 第13-14页 |
| 2 Ace2简介 | 第14-15页 |
| 3 转录调控因子与基因转录调控 | 第15-17页 |
| 3.1 转录因子概念 | 第15-16页 |
| 3.2 转录因子的结构 | 第16页 |
| 3.3 转录因子对基因的转录调作用 | 第16-17页 |
| 4 转录因子筛选和验证的方法 | 第17-20页 |
| 4.1 酵母单杂交筛选系统 | 第17-18页 |
| 4.2 染色质免疫共沉淀技术ChIP | 第18-19页 |
| 4.3 凝胶阻滞迁实验EMSA | 第19-20页 |
| 5 本论文研究目的和主要内容 | 第20-21页 |
| 第二章 RPS601对酵母核糖体蛋白基因rpl32-2转录调控作用的验证 | 第21-58页 |
| 第一节 粟酒裂殖酵母核糖体蛋白RPS601的异源表达菌株的构建 | 第21-30页 |
| 1 实验材料 | 第21-23页 |
| 1.1 PCR引物 | 第21-22页 |
| 1.2 所用酶和试剂盒 | 第22页 |
| 1.3 菌株和质粒 | 第22页 |
| 1.4 培养基 | 第22页 |
| 1.5 主要试剂 | 第22-23页 |
| 1.6 主要仪器设备及其来源 | 第23页 |
| 2 实验方法 | 第23-27页 |
| 2.1 粟酒裂殖酵母SP-Q01的基因rps601的克隆 | 第23-24页 |
| 2.2 目的基因rps601的回收与TA克隆 | 第24页 |
| 2.3 质粒pMD18-T/rps601的化转 | 第24-25页 |
| 2.4 阳性克隆菌株的筛选与鉴定 | 第25页 |
| 2.5 粟酒裂殖酵母SP-Q01的基因rps601原核异源重组表达菌的构建 | 第25-27页 |
| 3 结果 | 第27-30页 |
| 3.1 粟酒裂殖酵母基因组的提取 | 第27页 |
| 3.2 核糖体蛋白rps601基因的克隆 | 第27-28页 |
| 3.3 核糖体蛋白基因rps601表达载体的构建 | 第28-29页 |
| 3.4 核糖体蛋白基因rps601表达菌株的构建 | 第29-30页 |
| 4 讨论 | 第30页 |
| 第二节 核糖体蛋白RPS601的异源原核表达和纯化 | 第30-39页 |
| 1 实验材料 | 第31页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第31页 |
| 1.2 所用蛋白纯化系统和Western转膜系统 | 第31页 |
| 1.3 培养基 | 第31页 |
| 1.4 主要试剂 | 第31页 |
| 1.5 主要仪器和设备见第四章第一节 | 第31页 |
| 2 实验方法 | 第31-35页 |
| 2.1 重组核糖体蛋白His-RPS601的原核体外表达 | 第31-32页 |
| 2.2 重组核糖体蛋白His-RPS601的提取 | 第32页 |
| 2.3 SDS-PAGE的检测方法 | 第32-33页 |
| 2.4 亲和层析法纯化His-RPS601 | 第33-34页 |
| 2.5 透析处理纯化后的His-RPS601蛋白溶液 | 第34页 |
| 2.6 冷冻干燥处理透析后的His-RPS601蛋白 | 第34页 |
| 2.7 Western Blot检验His-RPS601蛋白的正确性 | 第34-35页 |
| 3 结果 | 第35-38页 |
| 3.1 核糖体蛋白His-RPS601异源表达 | 第35-36页 |
| 3.2 亲和层析法纯化核糖体蛋白His-RPS601 | 第36-37页 |
| 3.3 核糖体蛋白His-RPS601经冷冻干燥后的处理效果 | 第37页 |
| 3.4 Western Blot检验His-RPS601蛋白的正确性 | 第37-38页 |
| 4 讨论 | 第38-39页 |
| 第三节 EMSA方法研究粟酒裂殖酵母核糖体蛋白RPS601与rp132-2上游启动子的相互作用 | 第39-44页 |
| 1 实验材料 | 第39-40页 |
| 1.1 rpl32-2上游启动子5个片段的引物 | 第39-40页 |
| 1.2 所用试剂盒 | 第40页 |
| 1.3 所用主要试剂 | 第40页 |
| 1.4 所用主要仪器设备 | 第40页 |
| 2 实验方法 | 第40-41页 |
| 2.1 rpl32-2上游5个启动子片段的获得 | 第40页 |
| 2.2 EMSA非变性胶的配制 | 第40页 |
| 2.3 EMSA实验所需缓冲液的配制 | 第40-41页 |
| 2.4 EMSA电泳处理系统 | 第41页 |
| 3 实验结果 | 第41-44页 |
| 3.1 荧光标记的rpl32-2上游5个启动子片段 | 第41-42页 |
| 3.2 EMSA实验探究核糖体蛋RPS601与rpl32-2上游启动子的结合作用关系 | 第42-44页 |
| 4 讨论 | 第44页 |
| 第四节 CHIP-PCR研究粟酒裂殖酵母核糖体蛋白RPS601与rpl32-2上游启动子的相互作用 | 第44-58页 |
| 1 实验材料与方法 | 第45-47页 |
| 1.1 PCR引物 | 第45-46页 |
| 1.2 所用试剂盒和酶 | 第46页 |
| 1.3 所用主要溶液的配制 | 第46页 |
| 1.4 所用菌株 | 第46页 |
| 1.5 所用培养基 | 第46-47页 |
| 1.6 所用主要试剂 | 第47页 |
| 1.7 所用主要仪器设备 | 第47页 |
| 2 实验方法 | 第47-52页 |
| 2.1 粟酒裂殖酵母972h-基因组的提取 | 第47页 |
| 2.2 三步融合方法融合用于同源重组的目的片段 | 第47-49页 |
| 2.3 产物(5)的连接,化转和检测 | 第49-50页 |
| 2.4 检测构建的突变菌株SP-Q01S | 第50页 |
| 2.5 甲醛交联目的突变菌株SP-Q01S | 第50页 |
| 2.6 细胞匀浆液的制备 | 第50-51页 |
| 2.7 Western Blot检测蛋-RPS601-His的正确性 | 第51页 |
| 2.8 纯化沉淀的DNA | 第51页 |
| 2.9 以纯化的DNA为模板进行的PCR的反应体系和条件 | 第51-52页 |
| 3 实验结果 | 第52-56页 |
| 3.1 提裂殖酵母972h-的基因组 | 第52页 |
| 3.2 PCR扩增四个片段 | 第52-53页 |
| 3.3 DH10B菌落PCR验证融合片段 | 第53-54页 |
| 3.4 PCR验证构建的突变菌SP-Q01S | 第54-55页 |
| 3.5 染色质的剪切情况 | 第55页 |
| 3.6 Western Blot检测蛋白RPS601-His的正确性 | 第55-56页 |
| 3.7 CHIP-PCR扩增5个目的启动子片段 | 第56页 |
| 4 讨论 | 第56-58页 |
| 第三章 ace2作为酵母核糖体蛋白RPL32-2候选靶基因的研究 | 第58-83页 |
| 第一节 诱饵菌株的构建及其对AbA耐受性的测定 | 第58-66页 |
| 1 实验材料 | 第58-60页 |
| 1.1 所用菌株和质粒 | 第58页 |
| 1.2 所用主要试剂及其来源 | 第58-59页 |
| 1.3 所需要的培养基 | 第59页 |
| 1.4 所用主要仪器及来源 | 第59-60页 |
| 2 实验方法 | 第60-64页 |
| 2.1 双酶切质粒PAbAi和ace2上游1000bp启动子 | 第60页 |
| 2.2 双酶切产物进行切胶回收 | 第60-61页 |
| 2.3 双酶切产物进行酶连 | 第61页 |
| 2.4 酶连产物化转到大肠杆菌DH5 α中 | 第61页 |
| 2.5 菌落PCR验证阳性单克隆 | 第61-62页 |
| 2.6 提取大肠杆菌DH5α中的质粒 | 第62页 |
| 2.7 BstBI线性化重组质粒 | 第62页 |
| 2.8 线性化重组质粒化转到酵母Y1HGold中 | 第62-63页 |
| 2.9 酵母菌落PCR验证阳性克隆 | 第63-64页 |
| 2.10 诱饵菌对AbAi本底耐受性的测定 | 第64页 |
| 3 实验结果 | 第64-65页 |
| 3.1 双酶切PAbAi和ace2上游1000bp启动子的回收产物 | 第64页 |
| 3.2 大肠杆菌菌落PCR验证阳性单克隆 | 第64-65页 |
| 3.3 酵母菌落PCR验证阳性单克隆 | 第65页 |
| 3.4 诱饵菌对AbAi本底耐受性的测定 | 第65页 |
| 4 讨论 | 第65-66页 |
| 第二节 构建粟酒裂殖酵母972h-cDNA文库 | 第66-74页 |
| 1 实验材料 | 第66-67页 |
| 1.1 引物 | 第66页 |
| 1.2 所用菌株和质粒 | 第66页 |
| 1.3 所用试剂盒 | 第66页 |
| 1.4 所用培养基 | 第66页 |
| 1.5 所用主要仪器 | 第66-67页 |
| 1.6 所用主要试剂 | 第67页 |
| 2 实验方法 | 第67-71页 |
| 2.1 OMEGA试剂盒提取酵母RNA | 第67-68页 |
| 2.2 去除RNA中的DNA | 第68页 |
| 2.3 验RNA中DNA是否除尽 | 第68-69页 |
| 2.4 mRNA的纯化 | 第69页 |
| 2.5 mRNA反转录成单链的cDNA,SMART cDNA | 第69-70页 |
| 2.6 LD-PCR扩增单链cDNA生成双链cDNA | 第70-71页 |
| 2.7 纯化双链cDNA | 第71页 |
| 3 实验结果 | 第71-74页 |
| 3.1 提取酵母972h- TotaRNA | 第71-72页 |
| 3.2 去除Total RNA中的DNA | 第72页 |
| 3.3 验证DNA去除情况 | 第72-73页 |
| 3.4 mRNA纯化的质量 | 第73页 |
| 3.5 双链cDNA文库质量的检验 | 第73页 |
| 3.6 再次验证cDNA文库的质量 | 第73-74页 |
| 4 讨论 | 第74页 |
| 第三节 ace2潜在转录因子的筛选 | 第74-83页 |
| 1 实验材料 | 第74-76页 |
| 1.1 所用引物 | 第74-75页 |
| 1.2 所用菌株和质粒 | 第75页 |
| 1.3 所用试剂盒 | 第75页 |
| 1.4 所用培养基 | 第75-76页 |
| 1.5 所需主要溶液的配制 | 第76页 |
| 1.6 所用主要试剂和其来源 | 第76页 |
| 1.7 所用主要仪器和其来源 | 第76页 |
| 2 实验方法 | 第76-79页 |
| 2.1 酵母的化转 | 第76-78页 |
| 2.2 计算文库滴度 | 第78页 |
| 2.3 抽提酵母转化子的质粒 | 第78页 |
| 2.4 质粒电转到大肠杆菌DH10B中 | 第78-79页 |
| 2.5 大肠杆菌菌落PCR筛选阳性克隆 | 第79页 |
| 2.6 提取大肠杆菌DH10B阳性克隆的质粒并测序 | 第79页 |
| 3 实验结果 | 第79-82页 |
| 3.1 cDNA文库化转到诱饵菌后阳性单克隆的长出情况 | 第79-80页 |
| 3.2 文库的滴度 | 第80页 |
| 3.3 酵母转化子中的质粒为模板PCR筛选阳性克隆 | 第80-81页 |
| 3.4 通过测序和比对鉴定阳性克隆中cDNA的序列 | 第81-82页 |
| 4 讨论 | 第82-83页 |
| 第四章 全文总结 | 第83-85页 |
| 参考文献 | 第85-92页 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 | 第92-93页 |
| 致谢 | 第93页 |
