| 中文摘要 | 第1-7页 |
| 英文摘要 | 第7-12页 |
| 缩略词 | 第12-21页 |
| 第一部分 文献综述 | 第21-45页 |
| 第一章 MD防制研究进展 | 第21-27页 |
| 1 鸡马立克氏病疫苗研究进展 | 第21-24页 |
| 2 接种途径 | 第24页 |
| 3 抗病育种 | 第24页 |
| 4 生物安全性措施 | 第24-27页 |
| 第二章 鸡IL—18基因研究进展 | 第27-37页 |
| 1 不同动物IL-18的分子结构 | 第27-28页 |
| 2 IL-18的表达调控 | 第28-29页 |
| 3 IL-18受体 | 第29页 |
| 4 IL-18的生物学功能 | 第29-33页 |
| 5 IL-18的抗肿瘤细胞及其作用机制 | 第33-37页 |
| 第三章 NDV HN基因研究进展 | 第37-43页 |
| 1 NDV抗肿瘤机制 | 第37-39页 |
| 2 HN蛋白结构及其毒力基础 | 第39-41页 |
| 3 HN蛋白的抗肿瘤机制 | 第41-43页 |
| 研究目的意义 | 第43-45页 |
| 第二部分 实验研究 | 第45-129页 |
| 第四章 鸡IL-18成熟蛋白基因的克隆、序列分析及生物信息学分析 | 第45-57页 |
| 1 材料 | 第45-46页 |
| ·试验动物 | 第45页 |
| ·菌株与载体 | 第45-46页 |
| ·主要试剂 | 第46页 |
| ·试剂配制 | 第46页 |
| ·主要仪器 | 第46页 |
| 2 方法 | 第46-49页 |
| ·引物的设计与合成 | 第46-47页 |
| ·鸡体内IL-18的诱导 | 第47页 |
| ·鸡外周血单个核细胞总RNA的提取 | 第47页 |
| ·ChIL-18成熟蛋白基因的扩增及检测 | 第47-48页 |
| ·目的基因的克隆 | 第48页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第48页 |
| ·目的基因的核苷酸序列分析 | 第48页 |
| ·鸡IL-18成熟蛋白基因序列及推导蛋白质的生物信息学分析 | 第48-49页 |
| 3 结果 | 第49-55页 |
| ·鸡IL-18成熟蛋白基因的RT-PCR扩增 | 第49页 |
| ·重组质粒pMD18-T-ChIL18的鉴定 | 第49-50页 |
| ·ChIL18的序列测定 | 第50页 |
| ·ChIL-18成熟蛋白核苷酸、氨基酸序列同源性比对及进化分析 | 第50-51页 |
| ·疏水性分析结果 | 第51-52页 |
| ·跨膜区预测结果 | 第52-53页 |
| ·抗原性 | 第53页 |
| ·N-糖基化位点分析 | 第53-54页 |
| ·磷酸化位点分析 | 第54页 |
| ·二级结构预测结果 | 第54-55页 |
| 4 讨论 | 第55-56页 |
| 5 小结 | 第56-57页 |
| 第五章 鸡IL-18成熟蛋白基因的定点突变及序列分析 | 第57-63页 |
| 1 材料 | 第57-58页 |
| ·菌株与质粒 | 第57页 |
| ·主要试剂 | 第57页 |
| ·主要仪器 | 第57-58页 |
| 2 方法 | 第58-59页 |
| ·引物设计 | 第58页 |
| ·ChMIL-18基因中密码子的突变 | 第58页 |
| ·变构基因克隆载体的构建 | 第58-59页 |
| ·对测序结果进行生物信息学分析 | 第59页 |
| 3 结果 | 第59-60页 |
| ·ChMIL-18变构基因的获得 | 第59页 |
| ·变构基因克隆载体的构建及鉴定 | 第59-60页 |
| ·重组质粒pMD18-T—ChMIL18的序列测定 | 第60页 |
| 4 讨论 | 第60-61页 |
| 5 小结 | 第61-63页 |
| 第六章 鸡IL-18成熟蛋白基因变构体毕赤酵母表达载体的构建及表达 | 第63-75页 |
| 1 材料 | 第63-65页 |
| ·菌株与质粒 | 第63页 |
| ·检测引物 | 第63-64页 |
| ·血清 | 第64页 |
| ·工具酶及主要试剂 | 第64页 |
| ·培养基及试剂配制 | 第64页 |
| ·主要仪器 | 第64-65页 |
| 2 方法 | 第65-71页 |
| ·质粒pPICZαA的大量提取及纯化 | 第65页 |
| ·重组质粒pMD18-T-ChMIL18大量提取及纯化 | 第65页 |
| ·质粒pPICZαA和重组质粒pMD18-T-ChMIL18的双酶切及双酶切产物的纯化 | 第65-66页 |
| ·连接反应 | 第66页 |
| ·连接产物原核宿主菌JM109感受态细胞的转化 | 第66页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第66-67页 |
| ·重组质粒pPICZαA-ChMIL18/pPICZαA大量提取及线性化 | 第67-68页 |
| ·酵母菌X-33感受态细胞的制备 | 第68页 |
| ·电脉冲转化毕赤酵母 | 第68页 |
| ·高抗性阳性转化子的筛选 | 第68-69页 |
| ·阳性转化子的筛选 | 第69页 |
| ·重组毕赤酵母的诱导表达及检测 | 第69-70页 |
| ·重组毕赤酵母表达产物的检测及Western blot分析 | 第70-71页 |
| 3 结果 | 第71-73页 |
| ·重组质粒pPICZαA-ChMIL18的构建及鉴定 | 第71页 |
| ·重组质粒pPICZαA-ChMIL18酵母菌X-33的转化及阳性转化子的筛选 | 第71-72页 |
| ·重组鸡ChMIL-18的诱导表达、SDS-PAGE及Western blot分析 | 第72-73页 |
| 4 讨论 | 第73-74页 |
| 5 小结 | 第74-75页 |
| 第七章 NDV LaSota株HN基因的克隆及序列分析 | 第75-89页 |
| 1 材料 | 第75-76页 |
| ·病毒和鸡胚 | 第75页 |
| ·菌株和质粒 | 第75页 |
| ·主要试剂 | 第75页 |
| ·主要仪器 | 第75-76页 |
| 2 方法 | 第76-79页 |
| ·引物设计 | 第76页 |
| ·NDV LaSota株RNA的提取 | 第76页 |
| ·RT-PCR扩增NDV-HN基因片段 | 第76-77页 |
| ·PCR-HN基因回收产物与pMD18-T连接 | 第77页 |
| ·连接产物的转化 | 第77页 |
| ·重组质粒pMD18-T-HN的鉴定 | 第77-78页 |
| ·目的基因的核苷酸序列测定 | 第78页 |
| ·HN基因序列分析及推导蛋白质的生物信息学分析 | 第78-79页 |
| 3 结果 | 第79-86页 |
| ·RT-PCR扩增的HN基因片段 | 第79页 |
| ·克隆载体pMD18-T-HN的鉴定 | 第79页 |
| ·重组质粒pMD18-T-HN的序列测定 | 第79-81页 |
| ·HN同源性比对及进化树分析 | 第81-82页 |
| ·疏水性分析结果 | 第82页 |
| ·抗原性分析 | 第82-83页 |
| ·跨膜区预测结果 | 第83页 |
| ·磷酸化位点分析 | 第83-84页 |
| ·糖基化位点分析 | 第84-85页 |
| ·HN二级结构预测结果 | 第85-86页 |
| 4 讨论 | 第86-88页 |
| 5 小结 | 第88-89页 |
| 第八章 HN基因毕赤酵母表达载体pPICZαA—HN的构建及表达 | 第89-99页 |
| 1 材料 | 第89-90页 |
| ·菌株与质粒 | 第89页 |
| ·检测引物 | 第89页 |
| ·工具酶及主要试剂 | 第89-90页 |
| ·培养基及试剂配制 | 第90页 |
| ·主要仪器 | 第90页 |
| 2 方法 | 第90-94页 |
| ·重组质粒pMD18-T-HN的大量提取及纯化 | 第90页 |
| ·质粒pPICZαA和重组质粒pMD18-T-HN的双酶切及酶切产物的纯化 | 第90页 |
| ·连接反应 | 第90-91页 |
| ·连接产物原核宿主菌JM109感受态细胞的转化 | 第91页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第91-92页 |
| ·重组质粒pPICZαA-HN/pPICZαA大景提取及线性化 | 第92页 |
| ·酵母菌X-33感受态细胞的制备 | 第92页 |
| ·电脉冲转化毕赤酵母 | 第92页 |
| ·高抗性阳性转化子的筛选 | 第92页 |
| ·阳性转化子的筛选 | 第92-93页 |
| ·重组毕赤酵母的诱导表达及检测 | 第93页 |
| ·重组毕赤酵母表达产物的检测及Western blot分析 | 第93-94页 |
| 3 结果 | 第94-96页 |
| ·重组质粒pPICZαA-HN的构建及鉴定 | 第94页 |
| ·重组质粒pPICZαA-HN酵母菌X-33的转化及阳性转化子的筛选 | 第94-95页 |
| ·阳性转化子X-33/pPICZαA-HN的诱导表达、SDS-PAGE及Western blot分析 | 第95-96页 |
| 4 讨论 | 第96-98页 |
| 5 小结 | 第98-99页 |
| 第九章 鸡IL-18变构基因和HN基因融合毕赤酵母表达载体的构建及其表达 | 第99-109页 |
| 1 材料 | 第99-100页 |
| ·质粒和菌株 | 第99页 |
| ·主要试剂 | 第99页 |
| ·培养基及试剂配制 | 第99页 |
| ·主要仪器 | 第99-100页 |
| 2 方法 | 第100-102页 |
| ·引物设计 | 第100页 |
| ·融合基因片段HN和ChMIL-18的获得 | 第100-101页 |
| ·pBS SK-HN-ChMIL18克隆载体的构建 | 第101页 |
| ·重组质粒pPICZαA-HN-ChMIL18的构建 | 第101页 |
| ·重组质粒pPICZαA-HN-ChMIL18酵母菌X-33的转化 | 第101页 |
| ·高抗性阳性转化子的筛选 | 第101-102页 |
| ·阳性转化子的筛选 | 第102页 |
| ·重组毕赤酵母的诱导表达检测和Western blot分析 | 第102页 |
| 3 结果 | 第102-106页 |
| ·克隆载体pBS SK+-HN的鉴定 | 第102-103页 |
| ·重组质粒pBS SK+-HN-ChMIL18鉴定 | 第103页 |
| ·重组质粒pPICZαA-HN-ChMIL18的构建及鉴定 | 第103-104页 |
| ·HN-ChMIL18基因的序列测定 | 第104-105页 |
| ·重组质粒pPICZαA-HN-ChMIL18酵母菌X-33的转化及阳性转化子的筛选 | 第105-106页 |
| ·重组X-33/pPICZαA-HN-ChMIL18的诱导表达、SDS-PAGE及Western blot分析 | 第106页 |
| 4 讨论 | 第106-108页 |
| 5 小结 | 第108-109页 |
| 第十章 ChMIL-18、HN及HN-ChMIL-18表达条件的优化、表达产物的纯化及生物活性检测 | 第109-121页 |
| 1 材料 | 第109-110页 |
| ·菌种 | 第109页 |
| ·主要试剂 | 第109页 |
| ·培养基及Bradford法测定蛋白质含量所需试剂配制 | 第109页 |
| ·主要仪器和设备 | 第109-110页 |
| 2 方法 | 第110-113页 |
| ·毕赤酵母表达条件的优化 | 第110-111页 |
| ·毕赤酵母的高效表达 | 第111页 |
| ·毕赤酵母表达产物的纯化 | 第111-112页 |
| ·Bradford法测定蛋白质含量 | 第112页 |
| ·表达产物的活性检测 | 第112-113页 |
| 3 结果 | 第113-119页 |
| ·毕赤酵母表达条件优化的结果 | 第113-118页 |
| ·蛋白质含量测定结果 | 第118页 |
| ·鸡淋巴细胞转化实验结果 | 第118页 |
| ·血凝活性测定 | 第118-119页 |
| 4 讨论 | 第119-120页 |
| 5 小结 | 第120-121页 |
| 第十一章 ChMIL-18、HN及HN-ChMIL18融合蛋白协同抗MD肿瘤的研究 | 第121-129页 |
| 1 材料 | 第121页 |
| ·样品 | 第121页 |
| ·细胞 | 第121页 |
| ·主要试剂 | 第121页 |
| ·主要仪器 | 第121页 |
| 2 方法 | 第121-124页 |
| ·马立克肿瘤细胞系MSB—1的培养 | 第122页 |
| ·细胞生长抑制试验 | 第122页 |
| ·DNA琼脂糖凝胶电泳 | 第122-123页 |
| ·流式细胞仪检测 | 第123-124页 |
| 3 结果 | 第124-126页 |
| ·ChMIL-18、HN及HN-ChMIL18对MSB-1细胞的增殖抑制作用 | 第124页 |
| ·DNA琼脂糖凝胶电泳分析 | 第124-125页 |
| ·流式细胞仪结果 | 第125-126页 |
| 4 讨论 | 第126-127页 |
| 5 小结 | 第127-129页 |
| 第三部分 结论 | 第129-131页 |
| 第四部分 参考文献 | 第131-153页 |
| 第五部分 附录 | 第153-167页 |
| 附录一 SDS-PAGE主要溶液的配制 | 第153-157页 |
| 附录二 酵母及细胞培养常用试剂的配制 | 第157-161页 |
| 附录三 测序图 | 第161-167页 |
| 致谢 | 第167-169页 |
| 作者简介 | 第169页 |
