| 中文摘要 | 第1-13页 |
| 英文摘要 | 第13-17页 |
| 前言 | 第17-25页 |
| 选题背景 | 第17-22页 |
| 1.禽传染性支气管炎研究概况 | 第17-18页 |
| 2.禽传染性支气管炎基因工程疫苗研究概况 | 第18页 |
| 3.细胞因子作为基因佐剂的研究进展 | 第18-19页 |
| 4.双顺反子质粒载体的国内外研究进展 | 第19-21页 |
| 5.禽传染性支气管炎病毒分子生物学及mRNA3分子特性研究进展 | 第21-22页 |
| 本研究前期工作基础 | 第22-23页 |
| 存在的主要问题 | 第23页 |
| 本研究的内容和目的意义 | 第23-25页 |
| 第一章 S1、M、N、IL-2、IL-18目的基因鉴定及双顺反子表达质粒pIRES-EGFP/Red的构建、鉴定 | 第25-46页 |
| 摘要 | 第25页 |
| 1.引言 | 第25-27页 |
| 2.材料与方法 | 第27-34页 |
| ·材料 | 第27页 |
| ·质粒、宿主菌和细胞株 | 第27页 |
| ·工具酶及试剂 | 第27页 |
| ·主要仪器设备 | 第27页 |
| ·方法 | 第27-34页 |
| ·IL-2、IL-18基因的扩增及测序鉴定 | 第27-29页 |
| ·IBV S1、M、N结构基因的测序鉴定 | 第29页 |
| ·中间质粒pcEGFP的构建 | 第29-31页 |
| ·中间质粒pEGFP-IRES的构建 | 第31-32页 |
| ·双顺反子表达质粒pIRES-EGFP/Red的构建 | 第32-33页 |
| ·双顺反子表达质粒pIRES-EGFP/Red的表达检测 | 第33-34页 |
| 3.结果 | 第34-42页 |
| ·IL-2、IL-18基因的扩增及测序结果 | 第34-35页 |
| ·IBV S1、M、N结构基因的测序结果 | 第35-38页 |
| ·中间质粒pcEGFP的酶切鉴定 | 第38-39页 |
| ·中间质粒pEGFP-IRES的酶切鉴定 | 第39页 |
| ·双顺反子表达质粒pIRES-EGFP/Red的酶切鉴定 | 第39-40页 |
| ·双顺反子表达质粒pIRES-EGFP/Red表达检测结果 | 第40-42页 |
| 4.讨论 | 第42-44页 |
| ·S1、M、N、IL-2、IL-18目的基因的测序鉴定 | 第42-43页 |
| ·双顺反子表达质粒pIRES-EGFP/Red的构建与鉴定 | 第43-44页 |
| 5.小结 | 第44-46页 |
| 第二章 禽传染性支气管炎病毒结构蛋白基因S1、M、N分别与IL-2/IL-18双顺反子表达质粒的构建及鉴定 | 第46-65页 |
| 摘要 | 第46页 |
| 1.引言 | 第46-49页 |
| 2.材料与方法 | 第49-55页 |
| ·材料 | 第49页 |
| ·质粒、宿主菌和细胞株 | 第49页 |
| ·工具酶及试剂 | 第49页 |
| ·主要仪器设备 | 第49页 |
| ·方法 | 第49-55页 |
| ·中间质粒pIRES-S1/Red、pIRES-M/Red、pIRES-N/Red的构建 | 第49-51页 |
| ·双顺反子表达质粒pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2的构建 | 第51-52页 |
| ·双顺反子表达质粒pIRES-S1/IL18、pIRES-M/IL18、pIRES-N/IL18的构建 | 第52页 |
| ·pIRES-S1、pIRES-M、pIRES-N质粒的构建 | 第52-53页 |
| ·pIRES-IL2、pIRES-IL18质粒和空质粒的构建 | 第53页 |
| ·双顺反子表达质粒pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2、pIRES-S1/IL18、pIRES-M/IL18、pIRES-N/IL18的表达检测 | 第53-55页 |
| 3.结果 | 第55-63页 |
| ·pIRES-S1/Red、pIRES-M/Red、pIRES-N/Red质粒的酶切鉴定 | 第55-56页 |
| ·S1、M、N基因分别与IL-2、IL-18双顺反子质粒的酶切鉴定 | 第56-57页 |
| ·pIRES-S1、pIRES-M、pIRES-N质粒的酶切鉴定 | 第57-58页 |
| ·pIRES-IL2、pIRES-IL18质粒和空质粒的酶切鉴定 | 第58-59页 |
| ·S1、M、N基因分别与IL-2、IL-18双顺反子质粒转录产物的RT-PCR检测结果 | 第59-61页 |
| ·S1、M、N基因分别与IL-2、IL-18双顺反子质粒表达产物的间接免疫荧光检测结果 | 第61-63页 |
| 4.讨论 | 第63-64页 |
| ·结构基因与细胞因子双顺反子表达质粒的构建策略 | 第63页 |
| ·双顺反子表达质粒转染真核细胞的方法 | 第63-64页 |
| ·传染性支气管炎病毒结构蛋白基因的体外表达 | 第64页 |
| 5.小结 | 第64-65页 |
| 第三章 pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2、pIRES-S1/IL18、pIRES-M/IL18、pIRES-N/IL18双顺反子DNA疫苗的配制和免疫原性研究 | 第65-92页 |
| 摘要 | 第65-66页 |
| 1.引言 | 第66-67页 |
| 2.材料与方法 | 第67-73页 |
| ·材料 | 第67页 |
| ·实验动物和攻毒用毒株 | 第67页 |
| ·工具酶及试剂 | 第67页 |
| ·主要仪器设备 | 第67页 |
| ·方法 | 第67-73页 |
| ·质粒的制备与纯化 | 第68-69页 |
| ·脂质体的制备、转染效率的检测 | 第69页 |
| ·DNA疫苗的配制 | 第69页 |
| ·pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2、pIRES-S1/IL18、pIRES-M/IL18、pIRES-N/IL18双顺反子DNA疫苗的免疫原性研究 | 第69-73页 |
| 3.结果 | 第73-87页 |
| ·质粒的鉴定 | 第73页 |
| ·脂质体的电镜观察 | 第73-74页 |
| ·脂质体的转染效率检测 | 第74-75页 |
| ·pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2、pIRES-S1/IL18、pIRES-M/IL18、pIRES-N/IL18双顺反子DNA疫苗免疫后ELISA抗体效价的检测结果 | 第75-78页 |
| ·pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2、pIRES-S1/IL18、pIRES-M/IL18、pIRES-N/IL18双顺反子DNA疫苗免疫后外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的检测结果 | 第78-86页 |
| ·攻毒实验结果 | 第86-87页 |
| 4.讨论 | 第87-91页 |
| ·质粒的制备和DNA疫苗的配制 | 第87-88页 |
| ·S1、M、N基因与IL-2/IL-18双顺反子DNA疫苗的免疫效果 | 第88-89页 |
| ·双顺反子DNA疫苗与混合DNA疫苗免疫效果的比较 | 第89-90页 |
| ·关于攻毒保护率 | 第90-91页 |
| 5.小结 | 第91-92页 |
| 第四章 pIRES-M/E真核表达质粒的构建及免疫原性研究 | 第92-107页 |
| 摘要 | 第92页 |
| 1.引言 | 第92-94页 |
| 2.材料与方法 | 第94-98页 |
| ·材料 | 第94页 |
| ·质粒、细胞株和实验动物 | 第94页 |
| ·工具酶及试剂 | 第94页 |
| ·主要仪器设备 | 第94页 |
| ·方法 | 第94-98页 |
| ·病毒RNA提取 | 第94页 |
| ·E基因的RT-PCR扩增 | 第94-96页 |
| ·双顺反子表达质粒pIRES-M/E的构建 | 第96页 |
| ·双顺反子表达质粒pIRES-M/E的表达检测 | 第96-97页 |
| ·DNA疫苗的制备 | 第97页 |
| ·pIRES-M/E双顺反子DNA疫苗免疫后ELISA抗体效价的检测 | 第97-98页 |
| 3.结果 | 第98-105页 |
| ·E基因的RT-PCR扩增结果 | 第98页 |
| ·E基因的测序结果 | 第98-99页 |
| ·双顺反子表达质粒pIRES-M/E的酶切鉴定 | 第99页 |
| ·转录产物的RT-PCR检测结果 | 第99-100页 |
| ·pIRES-M/E双顺反子DNA疫苗的制备 | 第100-101页 |
| ·pIRES-M/E双顺反子DNA疫苗免疫后ELISA抗体效价的检测结果 | 第101-102页 |
| ·pIRES-M/E双顺反子DNA疫苗免疫后外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量的检测结果 | 第102-104页 |
| ·攻毒保护 | 第104-105页 |
| 4.讨论 | 第105-106页 |
| ·M基因和E基因共表达DNA疫苗的免疫原性 | 第105-106页 |
| 5.小结 | 第106-107页 |
| 第五章 禽传染性支气管炎病毒mRNA3的分子特性研究及其内部核糖体进入功能的检测 | 第107-126页 |
| 摘要 | 第107-108页 |
| 1.引言 | 第108-110页 |
| 2.材料与方法 | 第110-114页 |
| ·材料 | 第110页 |
| ·种毒、宿主菌和质粒 | 第110页 |
| ·分子生物学试剂 | 第110页 |
| ·生化试剂 | 第110页 |
| ·主要仪器设备 | 第110页 |
| ·方法 | 第110-114页 |
| ·病毒的增殖 | 第110页 |
| ·病毒RNA的提取 | 第110页 |
| ·引物的设计与合成 | 第110-111页 |
| ·mRNA3(3a3b3c)RT-PCR扩增、克隆及序列分析 | 第111-113页 |
| ·3a3b二级结构预测 | 第113页 |
| ·重组质粒p3a3b-EGFP/Red的构建及鉴定 | 第113-114页 |
| ·p3a3b-EGFP/Red与pIRES-EGFP/Red比较,分析3a3b内部核糖体进入位点的功能 | 第114页 |
| 3.结果 | 第114-123页 |
| ·mRNA3(3a3b3c)RT-PCR扩增、克隆测序、序列分析结果 | 第114-121页 |
| ·3a3b二级结构预测结果 | 第121-122页 |
| ·重组质粒p3a3b-EGFP/Red的鉴定结果 | 第122页 |
| ·p3a3b-EGFP/Red与pIRES-EGFP/Red的比较及3a3b内部核糖体进入位点的分析结果 | 第122-123页 |
| 4.讨论 | 第123-125页 |
| ·本研究所用毒株的mRNA3(3a3b3c)分子与国内外的比较及特点 | 第123-124页 |
| ·3a3b编码区二级结构预测结果 | 第124页 |
| ·3a3b与IRES序列的功能比较 | 第124-125页 |
| 5.小结 | 第125-126页 |
| 结论 | 第126-128页 |
| 文献综述 | 第128-147页 |
| 1.禽传染性支气管病毒的概述 | 第128页 |
| 2.禽传染性支气管炎基因工程疫苗研究进展 | 第128-131页 |
| 3.细胞因子作为基因佐剂的研究进展 | 第131-136页 |
| 4.双顺反子表达质粒的国内外研究进展 | 第136-140页 |
| 5.禽传染性支气管炎病毒分子生物学及mRNA3分子特性研究进展 | 第140-147页 |
| 参考文献 | 第147-158页 |
| 致谢 | 第158-159页 |
| 附录 | 第159-160页 |
| 在读博士期间发表的论文情况 | 第160页 |
