| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-11页 |
| 前言 | 第11-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-28页 |
| 1 弹性蛋白酶的来源、特性及其研究进展 | 第14-20页 |
| ·动物性来源的弹性蛋白酶特性及其研究进展 | 第14-16页 |
| ·微生物源的弹性蛋白酶特性及其研究进展 | 第16-20页 |
| 2 弹性蛋白酶的作用机理 | 第20-22页 |
| ·弹性蛋白的结构、性质 | 第20页 |
| ·弹性蛋白酶对弹性蛋白作用机理的研究进展 | 第20-22页 |
| 3 弹性蛋白酶的功能与用途 | 第22-25页 |
| ·弹性蛋白酶在医药方面的应用 | 第22-23页 |
| ·改善脂质代谢、保护肝脏和抑制动脉硬化 | 第22页 |
| ·降血压、耐缺氧保护心肌 | 第22-23页 |
| ·其它作用 | 第23页 |
| ·弹性蛋白酶在食品工业方面的应用 | 第23-24页 |
| ·弹性蛋白酶在日用化工方面的应用 | 第24页 |
| ·生物防治的辅助剂 | 第24页 |
| ·环境保护 | 第24-25页 |
| 4 弹性蛋白酶的应用前景和面临的问题 | 第25-26页 |
| 5 巴斯德毕赤酵母表达系统的应用 | 第26-28页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统的优越性 | 第26页 |
| ·毕赤酵母启动外源基因的表达机制及菌株与表型 | 第26-28页 |
| 第二章 材料与方法 | 第28-64页 |
| 1 材料和仪器 | 第28-32页 |
| ·材料 | 第28页 |
| ·试剂 | 第28-29页 |
| ·主要培养基 | 第29页 |
| ·主要溶液 | 第29-30页 |
| ·主要仪器设备 | 第30-31页 |
| ·引物设计与合成 | 第31-32页 |
| 2 实验方法 | 第32-45页 |
| ·proELA2基因的克隆 | 第32-35页 |
| ·胰腺组织总RNA的提取 | 第32页 |
| ·基因的扩增 | 第32-34页 |
| ·TA克隆和测序 | 第34-35页 |
| ·P.pastoris/pPICZαA-proELA2表达载体的构建 | 第35-38页 |
| ·含EcoR Ⅰ和XbaI限制性酶切位点目的基因片段扩增 | 第35-36页 |
| ·PCR产物和pPICZαA质粒的酶切与连接 | 第36-37页 |
| ·感受态细胞的转化与阳性克隆的筛选 | 第37-38页 |
| ·重组猪proELA2酶原的酵母转化与表达 | 第38-42页 |
| ·重组表达载体pPICZαA-proELA2的线性化 | 第38页 |
| ·pPICZαA-proELA2重组质粒毕赤酵母的转化与转化子的筛选 | 第38-41页 |
| ·重组猪proELA2酶原的诱导表达 | 第41页 |
| ·重组蛋白的纯化和Western blot验证 | 第41-42页 |
| ·摇瓶诱导表达条件的探索 | 第42-45页 |
| ·诱导时间对目的蛋白表达水平的影响 | 第43页 |
| ·抗性水平对目的蛋白表达水平的影响 | 第43页 |
| ·甲醇添加方式对目的蛋白表达水平的影响 | 第43-44页 |
| ·生长菌密度对目的蛋白表达水平的影响 | 第44页 |
| ·诱导培养液起始pH值对目的蛋白表达水平的影响 | 第44-45页 |
| 3 实验结果与分析 | 第45-56页 |
| ·猪胰proELA2编码基因TA克隆 | 第45-47页 |
| ·总RNA的提取与proELA2编码区RT-PCR扩增 | 第45页 |
| ·proELA2基因TA克隆 | 第45-46页 |
| ·pTA2-proELA2酶切鉴定及测序 | 第46-47页 |
| ·pPICZαA-ELA2重组表达质粒的构建及鉴定 | 第47-49页 |
| ·含酶切位点proELA2基因片段的扩增结果 | 第47页 |
| ·pPICZαA质粒的双酶切 | 第47-48页 |
| ·阳性克隆PCR检测与酶切鉴定 | 第48-49页 |
| ·P.pastoris/pPICZαA-proELA2表达菌株的转化与筛选 | 第49-51页 |
| ·重组质粒的线性化 | 第49-50页 |
| ·PCR检测转化子 | 第50页 |
| ·Real-Time RT-PCR对转化子RNA表达量的检测 | 第50-51页 |
| ·proELA2在P.pastoris中的表达、纯化与Western blot验证 | 第51-52页 |
| ·摇瓶诱导表达条件的探索 | 第52-56页 |
| ·诱导时间对目的蛋白表达水平的影响 | 第53页 |
| ·抗性水平对目的蛋白表达水平的影响 | 第53-54页 |
| ·甲醇添加方式对目的蛋白表达水平的影响 | 第54页 |
| ·初始菌密度对目的蛋白表达水平的影响 | 第54-55页 |
| ·pH值对目的蛋白表达水平的影响 | 第55-56页 |
| 4 讨论 | 第56-62页 |
| ·胰腺组织总RNA的提取 | 第56页 |
| ·巴斯德毕赤酵母菌的转化 | 第56-57页 |
| ·外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达 | 第57-58页 |
| ·毕赤酵母转化子的摇瓶诱导条件 | 第58-60页 |
| ·重组蛋白的降解问题 | 第58-59页 |
| ·诱导菌的起始密度和诱导时间 | 第59页 |
| ·甲醇的添加方式 | 第59页 |
| ·摇瓶内培养通气量、pH值、营养成份 | 第59-60页 |
| ·Zeocin抗性水平 | 第60页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第60-62页 |
| 5 结论与展望 | 第62-64页 |
| ·proELA2的激活与活性检测及其使用安全性评估 | 第62页 |
| ·优化proELA2工程菌的发酵工艺研究 | 第62页 |
| ·proELA2的稳定性与提高活性研究 | 第62-63页 |
| ·改造proELA2的分子结构提高其活性 | 第63页 |
| ·改变表达系统进行proELA2的表达 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-69页 |
| 附录 | 第69-71页 |
| 致谢 | 第71页 |
