| 中文摘要 | 第1-6页 |
| 英文摘要 | 第6-8页 |
| 缩略词 | 第8-11页 |
| 引言 | 第11页 |
| 一、绪论 | 第11-20页 |
| 1.文献综述 | 第11-18页 |
| ·羧肽酶A的研究进展 | 第11-14页 |
| ·添加外源消化酶对断奶仔猪的影响 | 第14-17页 |
| ·巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达体系 | 第17-18页 |
| 2.研究内容与方法 | 第18-20页 |
| ·猪proCPA1基因克隆 | 第18页 |
| ·pPICZαA-proCPA1重组表达质粒的构建 | 第18页 |
| ·P.pastoris/pPICZαA-proCPA1工程菌株的构建和筛选 | 第18页 |
| ·重组P.Pastoris X-33的表达及表达产物的鉴定 | 第18-20页 |
| 二、材料与方法 | 第20-37页 |
| 1.实验所用材料 | 第20-23页 |
| ·组织、质粒及菌株 | 第20页 |
| ·主要仪器设备 | 第20-21页 |
| ·主要试剂 | 第21页 |
| ·培养基、溶液配制 | 第21-23页 |
| 2.方法 | 第23-37页 |
| ·引物设计 | 第23-24页 |
| ·猪胰腺总RNA提取 | 第24页 |
| ·完整proCPA1编码区cDNA的扩增 | 第24-26页 |
| ·目的基因的克隆与鉴定 | 第26-28页 |
| ·毕赤酵母表达载体的构建 | 第28-32页 |
| ·pPICZαA-proCPA1重组质粒毕赤酵母细胞转化及转化子鉴定 | 第32-33页 |
| ·高RNA表达水平转化子的Real-Time RT-PCR筛选 | 第33-34页 |
| ·重组猪proCPA1的诱导表达及纯化 | 第34-35页 |
| ·纯化蛋白SDS-PAGE检测及Western blot分析 | 第35-36页 |
| ·纯化蛋白肽质量指纹图谱分析 | 第36-37页 |
| 三、实验结果与分析 | 第37-44页 |
| 1.猪proCPA1基因的克隆 | 第37-38页 |
| ·胰腺总RNA提取 | 第37页 |
| ·完整proCPA1编码区cDNA的扩增结果 | 第37页 |
| ·proCPA1基因的克隆 | 第37-38页 |
| 2.毕赤酵母表达载体的构建 | 第38-39页 |
| ·含酶切位点proCPA1基因片段的扩增结果 | 第38页 |
| ·pPICZαA质粒双酶切 | 第38-39页 |
| ·pPICZαA-proCPA1重组质粒的构建与鉴定 | 第39页 |
| 3.P.pastoris/pPICZαA-proCPA1工程菌株的构建与筛选 | 第39-40页 |
| 4.高RNA表达转化子的Real-Time RT-PCR筛选 | 第40-41页 |
| 5.proCPA1在P.pastoris中的表达、纯化与鉴定 | 第41-44页 |
| ·肽质量指纹图谱分析 | 第41-43页 |
| ·纯化蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析 | 第43-44页 |
| 四、讨论 | 第44-49页 |
| 1.胰腺组织总RNA的提取 | 第44页 |
| 2.表达载体的构建 | 第44-45页 |
| ·限制性内切酶的选择 | 第44页 |
| ·限制性内切酶的保护碱基 | 第44-45页 |
| ·基因片段扩增酶的选择 | 第45页 |
| ·线性化酶的选择 | 第45页 |
| 3.表达体系的选择 | 第45-46页 |
| 4.诱导表达情况 | 第46-47页 |
| 5.表达蛋白的纯化 | 第47页 |
| 6.纯化蛋白的Western Blot和肽质量指纹图谱分析 | 第47-49页 |
| ·Western Blot检测分析 | 第47-48页 |
| ·肽质量指纹图谱分析 | 第48-49页 |
| 五、结论与展望 | 第49-50页 |
| 参考文献 | 第50-54页 |
| 附录 | 第54-55页 |
| 致谢 | 第55页 |
