| 致谢 | 第7-8页 |
| 摘要 | 第8-9页 |
| 1 文献综述 | 第9-18页 |
| 1.1 污水处理的研究现状 | 第9-10页 |
| 1.2 生物效应器的应用及研究进展 | 第10-15页 |
| 1.2.1 DntR的来源及概述 | 第11-12页 |
| 1.2.2 DntR的晶体结构及作用特点 | 第12-13页 |
| 1.2.3 DntR的研究进展 | 第13-15页 |
| 1.3 突变体文库构建策略 | 第15-17页 |
| 1.3.1 突变体基因获取方法 | 第15-16页 |
| 1.3.2 突变体文库筛选方法 | 第16-17页 |
| 1.4 本论文的研究目的及意义 | 第17-18页 |
| 2 引言 | 第18-19页 |
| 3 材料和方法 | 第19-33页 |
| 3.1 材料 | 第19-20页 |
| 3.1.1 菌种和质粒载体 | 第19页 |
| 3.1.2 生化试剂、酶及试剂盒 | 第19页 |
| 3.1.3 相关溶液及培养基 | 第19-20页 |
| 3.1.4 引物合成及核酸测序 | 第20页 |
| 3.1.5 仪器设备 | 第20页 |
| 3.2 实验方法 | 第20-33页 |
| 3.2.1 pRB1k-DntR载体构建 | 第20-26页 |
| 3.2.1.1 EpI400菌株培养 | 第20-21页 |
| 3.2.1.2 质粒DNA提取 | 第21页 |
| 3.2.1.3 酶切鉴定 | 第21页 |
| 3.2.1.4 电泳检测 | 第21页 |
| 3.2.1.5 PCR产物或酶切产物回收 | 第21-22页 |
| 3.2.1.6 实验中所用引物 | 第22页 |
| 3.2.1.7 DntR调控基因全长序列扩增 | 第22-23页 |
| 3.2.1.8 重叠交错延伸PCR扩增 | 第23-24页 |
| 3.2.1.9 PCR产物及外源载体双酶切处理 | 第24-25页 |
| 3.2.1.10 酶切产物回收 | 第25页 |
| 3.2.1.11 甘油-水洗法感受态细胞制备 | 第25页 |
| 3.2.1.12 DntR基因大肠杆菌重组质粒载体构建 | 第25-26页 |
| 3.2.1.13 pRB1K-DntR重组质粒DNA功能验证 | 第26页 |
| 3.2.2 DntR突变基因文库构建 | 第26-29页 |
| 3.2.2.1 DntR突变体基因全长序列扩增 | 第26-28页 |
| 3.2.2.2 MegaWhop PCR扩增 | 第28页 |
| 3.2.2.3 Megawhop PCR产物甲基化处理 | 第28页 |
| 3.2.2.4 突变体丰度检测 | 第28页 |
| 3.2.2.5 突变体文库构建 | 第28页 |
| 3.2.2.6 电击转化流程 | 第28-29页 |
| 3.2.2.7 突变体数量富集 | 第29页 |
| 3.2.2.8 诱导剂邻苯二酚对宿主菌生长影响实验 | 第29页 |
| 3.2.3 突变体文库的高通量筛选 | 第29-32页 |
| 3.2.3.1 突变体文库预筛选 | 第29-30页 |
| 3.2.3.2 突变体筛选 | 第30-31页 |
| 3.2.3.3 潜在突变体进一步筛选、验证 | 第31页 |
| 3.2.3.4 诱导物灵敏度实验 | 第31-32页 |
| 3.2.3.5 底物谱实验 | 第32页 |
| 3.2.4 正向突变体同源建模及构效关系分析 | 第32-33页 |
| 4 实验结果与分析 | 第33-48页 |
| 4.1 DntR调控基因PCR扩增结果 | 第33页 |
| 4.2 PRB1K-DntR重组质粒的构建 | 第33-34页 |
| 4.3 重组质粒PRB1K-DntR验证 | 第34页 |
| 4.4 重组质粒荧光信号值检测 | 第34-36页 |
| 4.4.1 酶标仪荧光信号值检测 | 第35页 |
| 4.4.2 流式细胞仪样品分析 | 第35-36页 |
| 4.4.3 荧光倒置显微镜检测 | 第36页 |
| 4.5 DntR突变体文库构建及突变丰度验证 | 第36-38页 |
| 4.5.1 DntR突变体基因克隆 | 第36-37页 |
| 4.5.2 DntR突变体文库构建 | 第37页 |
| 4.5.3 突变体文库丰度验证 | 第37-38页 |
| 4.6 诱导剂邻苯二酚浓度选择 | 第38页 |
| 4.7 突变体文库预筛选 | 第38-40页 |
| 4.7.1 荧光值检测 | 第38-39页 |
| 4.7.2 流式细胞仪检测 | 第39-40页 |
| 4.8 突变体文库筛选 | 第40-41页 |
| 4.8.1 荧光信号值检测 | 第40页 |
| 4.8.2 流式细胞仪检测 | 第40-41页 |
| 4.9 潜在正向突变体筛选 | 第41-42页 |
| 4.9.1 潜在突变体单菌落初筛 | 第41-42页 |
| 4.9.2 潜在突变体测序分析 | 第42页 |
| 4.9.3 潜在突变体荧光值检测 | 第42页 |
| 4.10 正向突变体功能验证 | 第42-44页 |
| 4.10.1 灵敏度实验 | 第42-44页 |
| 4.10.2 底物谱实验 | 第44页 |
| 4.11 构效关系分析 | 第44-48页 |
| 5 结论与讨论 | 第48-50页 |
| 5.1 结论 | 第48页 |
| 5.2 讨论 | 第48-50页 |
| 参考文献 | 第50-55页 |
| ABSTRACT | 第55-56页 |
