| 摘要 | 第8-11页 |
| ABSTRACT | 第11-13页 |
| 缩略词表 | 第14-15页 |
| 第一章 水稻CRISPR/CAS9技术构建 | 第15-84页 |
| 1 前言 | 第15-46页 |
| 1.1 研究问题的由来 | 第15-16页 |
| 1.2 植物突变体构建方法的研究进展 | 第16-29页 |
| 1.2.1 随机诱变 | 第17-23页 |
| 1.2.1.1 物理诱变 | 第17-18页 |
| 1.2.1.2 化学诱变 | 第18-20页 |
| 1.2.1.3 DNA标签插入诱变 | 第20-23页 |
| 1.2.2 定点诱变 | 第23-29页 |
| 1.2.2.1 ZFN的原理及构建方法 | 第25-26页 |
| 1.2.2.2 TALEN原理及构建方法 | 第26-27页 |
| 1.2.2.3 CRISPR/CAS原理及构建方法 | 第27-29页 |
| 1.3 CRISPR/CAS9技术目前的研究进展 | 第29-45页 |
| 1.3.1 提高CRISPR/Cas9系统的生产力 | 第29-34页 |
| 1.3.1.1 针对CAS9进行密码子的优化 | 第30页 |
| 1.3.1.2 提高CRISPR/CAS9基因编辑特异性和效率 | 第30-32页 |
| 1.3.1.3 提高CRISPR/CAS9基因编辑后突变的遗传稳定性 | 第32-33页 |
| 1.3.1.4 使用CRISPR/CAS9进行多基因编辑 | 第33-34页 |
| 1.3.2 提高CRISPR/Cas9系统的质量控制 | 第34-45页 |
| 1.3.2.1 CRISPR/Cas9基因组编辑突变的检测 | 第35-36页 |
| 1.3.2.2 筛选稳定遗传株系 | 第36-38页 |
| 1.3.2.3 时空特异性基因编辑 | 第38-42页 |
| 1.3.2.4 提高CRISPR/CAS9基因编辑系统的精确性 | 第42-45页 |
| 1.3.2.5 获取不带有转基因片段的突变株系 | 第45页 |
| 1.4 研究的目的和意义 | 第45-46页 |
| 2 材料和方法 | 第46-55页 |
| 2.1 水稻诱导型CRISPR/CAS9骨架载体的构建 | 第46-47页 |
| 2.2 水稻高效CRISPR/CAS9基因编辑骨架载体的构建 | 第47页 |
| 2.3 构建单sgRNA元件的CRISPR/CAS9载体 | 第47-49页 |
| 2.4 通过两步酶切连接构建双sgRNA元件的CRISPR/CAS9载体 | 第49-50页 |
| 2.5 通过一步酶切连接构建双sgRNA元件的CRISPR/CAS9载体 | 第50-52页 |
| 2.6 构建双RGR元件的CRISPR/CAS9载体 | 第52-54页 |
| 2.7 将双RGR元件和普通sgRNA转录单元组合 | 第54页 |
| 2.8 构建PolⅡ型启动子驱动双RGR元件的载体 | 第54页 |
| 2.9 转基因阳性苗的检测 | 第54-55页 |
| 2.10 CRISPR/CAS9突变形式的检测与分析 | 第55页 |
| 3 结果与分析 | 第55-74页 |
| 3.1 水稻诱导型CRISPR/CAS9基因编辑效果检测 | 第55-57页 |
| 3.2 利用CRISPR/CAS9建立水稻中高效基因编辑系统 | 第57-59页 |
| 3.3 一种sgRNA靶向多个位点的基因编辑 | 第59-61页 |
| 3.4 使用多sgRNA转录盒进行多位点基因编辑 | 第61-64页 |
| 3.4.1 使用连续酶切的方法构建多sgRNA转录盒 | 第62-63页 |
| 3.4.2 使用一步酶切连接法构建多sgRNA转录盒 | 第63-64页 |
| 3.5 利用RGR技术进行多位点基因编辑 | 第64-66页 |
| 3.6 将已构建好的CRISPR载体与RGR元件组合应用于多基因编辑 | 第66-70页 |
| 3.7 水稻中使用PolⅡ类型的启动子启动sgRNA的效果 | 第70-74页 |
| 4 讨论 | 第74-84页 |
| 4.1 CRISPR/CAS9基因编辑材料的遗传稳定性 | 第74-75页 |
| 4.2 诱导型CRISPR/CAS9基因编辑的优点 | 第75-76页 |
| 4.3 快速获取可以稳定遗传的突变体 | 第76-77页 |
| 4.4 靶序列设计的注意事项 | 第77-78页 |
| 4.5 基因编辑材料的检测 | 第78-79页 |
| 4.6 多位点基因编辑的注意事项 | 第79-80页 |
| 4.7 RGR技术的应用范围 | 第80-81页 |
| 4.8 展望 | 第81-84页 |
| 4.8.1 利用CRISPR/CAS9构建水稻的突变体库 | 第81页 |
| 4.8.2 使用CRISPR/CAS9技术进行定点插入或替换 | 第81-82页 |
| 4.8.3 使用CRISPR/CAS9技术进行更加精确的点突变 | 第82页 |
| 4.8.4 利用CRISPR技术进行体外DNA编辑和克隆 | 第82-83页 |
| 4.8.5 CRISPR/CAS9技术对水稻育种的作用 | 第83-84页 |
| 第二章 花发育相关基因OsPIDa的功能研究 | 第84-155页 |
| 1 前言 | 第84-94页 |
| 1.1 研究问题的由来 | 第84-85页 |
| 1.2 生长素相关基因的研究进展 | 第85-89页 |
| 1.2.1 生长素合成 | 第85-87页 |
| 1.2.2 生长素运输 | 第87-88页 |
| 1.2.3 生长素信号传导 | 第88-89页 |
| 1.3 生长素对水稻生长发育的影响 | 第89-93页 |
| 1.3.1 生长素调节水稻株型 | 第89页 |
| 1.3.2 生长素调控水稻花序发育 | 第89-91页 |
| 1.3.3 生长素影响水稻种子发育 | 第91页 |
| 1.3.4 生长素控制水稻根系的发育 | 第91-92页 |
| 1.3.5 生长素参与水稻胁迫反应 | 第92-93页 |
| 1.4 研究的目的和意义 | 第93-94页 |
| 2 材料和方法 | 第94-105页 |
| 2.1 水稻材料及田间种植 | 第94页 |
| 2.2 菌株和载体 | 第94-95页 |
| 2.3 水稻T-DNA突变体的筛选 | 第95页 |
| 2.4 水稻TILLING突变体的筛选 | 第95-97页 |
| 2.5 水稻穗部性状的考察 | 第97页 |
| 2.6 水稻不同时期幼穗取样 | 第97-99页 |
| 2.7 水稻花粉粒育性的初步考察 | 第99页 |
| 2.8 各种载体的构建 | 第99-100页 |
| 2.8.1 过量表达载体与互补载体的构建 | 第99-100页 |
| 2.8.2 亚细胞定位载体的构建 | 第100页 |
| 2.8.3 CRISPR/CAS9载体的构建 | 第100页 |
| 2.9 水稻的基因型检测 | 第100-102页 |
| 2.9.1 T-DNA插入突变体的基因型检测 | 第100-101页 |
| 2.9.2 TILLING突变体的基因型检测 | 第101页 |
| 2.9.3 CRISPR/CAS9突变体的基因型检测 | 第101-102页 |
| 2.10 拟南芥原生质体的亚细胞定位 | 第102-104页 |
| 2.11 多序列比对与进化树分析 | 第104-105页 |
| 2.12 水稻表达谱数据分析 | 第105页 |
| 3 结果与分析 | 第105-149页 |
| 3.1 PID基因家族的同源比对与进化树分析 | 第105-111页 |
| 3.2 OsPID基因家族T-DNA插入突变体的筛选与鉴定 | 第111-113页 |
| 3.3 通过T-DNA插入突变体构建OsPID家族基因的双突变体 | 第113-114页 |
| 3.4 OsPID家族相关基因的TILLING突变体的筛选与鉴定 | 第114-117页 |
| 3.5 ospida-1,ospida-2突变体导致水稻结实率下降 | 第117-118页 |
| 3.6 ospida-1,ospida-2的遗传分析 | 第118-121页 |
| 3.6.1 ospida-1的基因型检测与遗传分析 | 第118-119页 |
| 3.6.2 ospida-2的基因型检测与遗传分析 | 第119-121页 |
| 3.7 ospida突变体对穗发育的影响 | 第121-130页 |
| 3.7.1 ospida突变体对穗部农艺性状的影响 | 第121-122页 |
| 3.7.2 ospida小花整体出现畸变 | 第122-126页 |
| 3.7.3 ospida-1的柱头严重退化 | 第126页 |
| 3.7.4 ospida-1雄蕊发生融合,花粉粒发育不良 | 第126-129页 |
| 3.7.5 ospida-1发生变异起始于枝梗原基发育之后 | 第129-130页 |
| 3.8 用OsPIDa的基因组序列互补ospida-1突变体 | 第130-132页 |
| 3.9 OsPIDa过量表达的效果 | 第132-135页 |
| 3.10 OsPIDa的表达谱分析 | 第135-137页 |
| 3.11 通过CRISPR/CAS9技术构建OsPIDa的突变体 | 第137-140页 |
| 3.12 OsPIDb的功能分析以及与OsPIDa的遗传关系 | 第140-145页 |
| 3.13 初步分析OsPIDa与几个花发育相关基因的关系 | 第145-147页 |
| 3.14 OsPIDa的亚细胞定位 | 第147-149页 |
| 4 讨论 | 第149-155页 |
| 4.1 水稻中生长素相关基因的鉴定 | 第149-150页 |
| 4.2 水稻生长素突变体的表型观察 | 第150页 |
| 4.3 OsPIDa对水稻花发育的影响和意义 | 第150-152页 |
| 4.4 OsPIDa在不同植物系统中的异同点 | 第152页 |
| 4.5 OsPID家族中其它基因的功能研究 | 第152-153页 |
| 4.6 展望 | 第153-155页 |
| 4.6.1 OsPIDa其他功能推测 | 第153页 |
| 4.6.2 OsPIDa在育种上的作用 | 第153-155页 |
| 参考文献 | 第155-183页 |
| 附录1 | 第183-221页 |
| 本研究所用引物信息 | 第183-188页 |
| 靶序列信息表 | 第188-189页 |
| 部分实验的详细操作程序 | 第189-221页 |
| 水稻的杂交 | 第189-190页 |
| 水稻总DNA的抽提 | 第190-192页 |
| 水稻总RNA的抽提 | 第192-196页 |
| 水稻的遗传转化 | 第196-206页 |
| 水稻RNA反转录 | 第206-208页 |
| 荧光实时定量PCR | 第208-211页 |
| 扫描电镜制样与观察 | 第211-213页 |
| 石蜡组织切片 | 第213-221页 |
| 附录Ⅱ 在读期间研究成果 | 第221-222页 |
| 致谢 | 第222-226页 |
