| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 前言 | 第17-18页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-39页 |
| 1.1 肌内脂肪 | 第18-28页 |
| 1.1.1 肌内脂肪组织及其病理生理作用 | 第18-19页 |
| 1.1.2 肌内脂肪的来源 | 第19-20页 |
| 1.1.3 肌肉卫星干细胞的特点 | 第20-21页 |
| 1.1.4 肌卫星细胞的成脂分化 | 第21-22页 |
| 1.1.5 调控肌卫星细胞转变为脂肪细胞的分子机制 | 第22-24页 |
| 1.1.6 肌肉卫星细胞的再生能力和修复 | 第24-25页 |
| 1.1.7 线粒体生物合成及其对肌肉卫星细胞分化的作用 | 第25-28页 |
| 1.2 肉牛大理石花纹 | 第28-32页 |
| 1.2.1 肉牛大理石花纹(肌内脂肪)的形成机制 | 第28-30页 |
| 1.2.2 牛大理石花纹形成相关的QTL和候选基因 | 第30-31页 |
| 1.2.3 胎儿阶段是增加牛肉大理石花纹最有效的阶段 | 第31-32页 |
| 1.3 CIDEC/FSP27研究进展 | 第32-39页 |
| 1.3.1 CIDE蛋白组织分布 | 第32-33页 |
| 1.3.2 CIDE蛋白的亚细胞定位 | 第33页 |
| 1.3.3 CIDE蛋白受转录和转录后水平的调控 | 第33-34页 |
| 1.3.4 CIDE蛋白和脂质代谢的关系 | 第34-35页 |
| 1.3.5 CIDE蛋白和糖代谢的关系 | 第35-36页 |
| 1.3.6 CIDE蛋白和代谢紊乱的关系 | 第36-37页 |
| 1.3.7 CIDE蛋白调控代谢疾病的分子机制 | 第37页 |
| 1.3.8 CIDEC与人类肥胖的关系 | 第37-38页 |
| 1.3.9 CIDEC受PPARg2的转录激活 | 第38-39页 |
| 第二章 牛CIDEC的表达谱分析 | 第39-44页 |
| 2.1 材料与方法 | 第39-40页 |
| 2.1.1 试验动物 | 第39页 |
| 2.1.2 组织样品的采集 | 第39页 |
| 2.1.3 RNA提取及cDNA第一链的合成 | 第39-40页 |
| 2.1.4 定量引物设计 | 第40页 |
| 2.1.5 实时定量PCR程序 | 第40页 |
| 2.1.6 统计分析 | 第40页 |
| 2.2 结果与分析 | 第40-42页 |
| 2.2.1 RNA的提取 | 第40页 |
| 2.2.2 cDNA第一链的合成 | 第40-41页 |
| 2.2.3 实时定量PCR | 第41页 |
| 2.2.4 CIDEC基因在新生秦川牛不同组织中的表达 | 第41-42页 |
| 2.2.5 CIDEC基因在成年秦川牛不同组织中的表达 | 第42页 |
| 2.3 讨论 | 第42-43页 |
| 2.3.1 CIDEC基因在犊牛和成年牛不同组织中的表达趋势相似 | 第42页 |
| 2.3.2 牛CIDEC的表达谱与其他物种相似 | 第42-43页 |
| 2.3.3 牛CIDEC基因对白色脂肪组织具有重要作用 | 第43页 |
| 2.4 小结 | 第43-44页 |
| 第三章 CIDEC基因的遗传变异与牛生产性能的关联分析及验证 | 第44-61页 |
| 3.1 材料与方法 | 第44-48页 |
| 3.1.1 试验动物 | 第44页 |
| 3.1.2 DNA的提取及质量检测、稀释 | 第44-45页 |
| 3.1.3 混合基因组DNA池的构建 | 第45页 |
| 3.1.4 引物设计 | 第45页 |
| 3.1.5 PCR反应程序 | 第45-46页 |
| 3.1.6 引入酶切引物的设计 | 第46页 |
| 3.1.7 Forced-PCR-RFLP分析 | 第46-47页 |
| 3.1.8 电泳图像分析 | 第47页 |
| 3.1.9 统计与分析 | 第47页 |
| 3.1.10 CIDEC基因不同单倍型的扩增与纯化回收 | 第47页 |
| 3.1.11 CIDEC基因不同单倍型以及pGL3-Basic空载体的酶切与纯化回收 | 第47页 |
| 3.1.12 CIDEC基因不同单倍型与pGL3-Basic空载体的连接 | 第47-48页 |
| 3.1.13 CIDEC基因不同单倍型载体的转化,鉴定及质粒提取 | 第48页 |
| 3.1.14 CIDEC基因不同单倍型载体的转染 | 第48页 |
| 3.1.15 CIDEC基因不同单倍型载体相对转录活性的测定 | 第48页 |
| 3.2 结果与分析 | 第48-57页 |
| 3.2.1 基因组DNA样品的琼脂糖凝胶电泳分析 | 第48-49页 |
| 3.2.2 CIDEC基因PCR产物检测结果 | 第49-50页 |
| 3.2.3 CIDEC基因Forced-PCR-RFLP分析 | 第50页 |
| 3.2.4 CIDEC基因PCR产物的Forced-PCR-RFLP分析 | 第50-52页 |
| 3.2.5 CIDEC基因3个SNPs位点的遗传多态性指标 | 第52-53页 |
| 3.2.6 CIDEC基因3个SNPs位点在5个牛群体的连锁分析 | 第53页 |
| 3.2.7 CIDEC基因3个SNPs位点在5个牛群体的单倍型分析 | 第53-54页 |
| 3.2.8 CIDEC基因3个SNPs位点与南阳牛体重、日增重的关联分析 | 第54-55页 |
| 3.2.9 CIDEC基因10个SNPs位点与顺式作用元件识别序列的关联分析 | 第55-56页 |
| 3.2.10 牛CIDEC基因不同单倍型的构建 | 第56页 |
| 3.2.11 牛CIDEC基因不同单倍型转录活性的验证 | 第56-57页 |
| 3.3 讨论 | 第57-59页 |
| 3.3.1 牛CIDEC基因编码区比较保守 | 第57页 |
| 3.3.2 牛CIDEC基因H8单倍型为优势单倍型 | 第57-58页 |
| 3.3.3 牛CIDEC基因不同单倍型与顺式作用元件的关系 | 第58页 |
| 3.3.4 牛CIDEC基因不同单倍型的转录活性分析 | 第58-59页 |
| 3.4 小结 | 第59-61页 |
| 第四章 牛CIDEC的亚细胞定位分析 | 第61-67页 |
| 4.1 材料与方法 | 第61-63页 |
| 4.1.1 脂肪组织RNA的提取与cDNA第一链的合成 | 第61页 |
| 4.1.2 牛CIDEC和PPARg的克隆 | 第61-62页 |
| 4.1.3 牛CIDEC和PPARg真核表达载体的构建 | 第62-63页 |
| 4.1.4 牛CIDEC和PPARg的亚细胞定位 | 第63页 |
| 4.2 结果与分析 | 第63-65页 |
| 4.2.1 牛CIDEC和PPARg的克隆 | 第63-64页 |
| 4.2.2 牛CIDEC和PPARg的亚细胞定位 | 第64-65页 |
| 4.3 讨论 | 第65-66页 |
| 4.3.1 牛CIDEC蛋白位于细胞质中而PPARg蛋白位于细胞核 | 第65页 |
| 4.3.2 牛PPARg可能通过转录水平调控CIDEC | 第65-66页 |
| 4.4 小结 | 第66-67页 |
| 第五章 牛CIDEC启动子区PPRE反应元件的验证 | 第67-74页 |
| 5.1 材料与方法 | 第67-69页 |
| 5.1.1 CIDEC启动子以及PPRE反应元件的预测 | 第67页 |
| 5.1.2 CIDEC启动子不同截短体的克隆 | 第67-69页 |
| 5.1.3 CIDEC启动子不同截短体的构建 | 第69页 |
| 5.1.4 CIDEC启动子不同截短体转录活性的测定 | 第69页 |
| 5.1.5 统计分析 | 第69页 |
| 5.2 结果与分析 | 第69-71页 |
| 5.2.1 牛CIDEC不同截短体的载体构建 | 第69-70页 |
| 5.2.2 牛CIDEC不同截短体的活性测定 | 第70-71页 |
| 5.3 讨论 | 第71-73页 |
| 5.3.1 牛CIDEC的核心启动子区位于-1936到-1336 | 第71-72页 |
| 5.3.2 牛CIDEC启动子区包含有活性的PPRE反应元件 | 第72-73页 |
| 5.4 小结 | 第73-74页 |
| 第六章 牛CIDEC克隆及原核表达研究 | 第74-83页 |
| 6.1 材料与方法 | 第74-77页 |
| 6.1.1 脂肪组织RNA的提取与cDNA第一链的合成 | 第74页 |
| 6.1.2 牛CIDEC的序列分析 | 第74-75页 |
| 6.1.3 牛CIDEC原核表达载体的构建 | 第75-76页 |
| 6.1.4 牛CIDEC的诱导表达条件的优化 | 第76页 |
| 6.1.5 牛CIDEC蛋白的Western blot检测 | 第76-77页 |
| 6.2 结果与分析 | 第77-81页 |
| 6.2.1 牛CIDEC序列分析结果 | 第77-78页 |
| 6.2.2 CIDEC蛋白序列起源进化分析 | 第78-79页 |
| 6.2.3 pET-28a(+)-CIDEC载体构建 | 第79页 |
| 6.2.4 重组质粒pET-28a(+)-CIDEC最佳表达条件的筛选 | 第79-80页 |
| 6.2.5 牛CIDEC重组蛋白的检测 | 第80-81页 |
| 6.3 讨论 | 第81-82页 |
| 6.3.1 牛CIDEC蛋白包含CIDE家族的N端和C端结构域 | 第81页 |
| 6.3.2 CIDEC蛋白N端保守性比C端保守性差 | 第81页 |
| 6.3.3 牛CIDEC蛋白与狗、猪的CIDEC蛋白同源性较高 | 第81-82页 |
| 6.3.4 秦川牛CIDEC未发现剪切体 | 第82页 |
| 6.3.5 pET-28a(+)-CIDEC表达量较低 | 第82页 |
| 6.4 小结 | 第82-83页 |
| 第七章 CIDEC在牛原代脂肪细胞的超表达研究 | 第83-93页 |
| 7.1 材料与方法 | 第83-86页 |
| 7.1.1 引物设计 | 第83-84页 |
| 7.1.2 pAdTrack-CMV-CIDEC载体构建 | 第84-85页 |
| 7.1.3 重组腺病毒载体pAdTrack-CMV-CIDEC的PmeⅠ酶切线性化 | 第85页 |
| 7.1.4 Ad-CIDEC的载体构建 | 第85页 |
| 7.1.5 Ad-CIDEC的PacI线性化 | 第85页 |
| 7.1.6 HEK293A细胞的培养 | 第85页 |
| 7.1.7 牛CIDEC重组腺病毒的包装与扩繁 | 第85-86页 |
| 7.1.8 牛CIDEC腺病毒滴度的测定以及最佳MOI确定 | 第86页 |
| 7.1.9 牛原代脂肪细胞的培养 | 第86页 |
| 7.1.10 牛CIDEC对细胞凋亡的影响 | 第86页 |
| 7.1.11 统计分析 | 第86页 |
| 7.2 结果与分析 | 第86-91页 |
| 7.2.1 pAdTrack-CMV-CIDEC载体构建 | 第86-87页 |
| 7.2.2 Ad-CIDEC的载体构建 | 第87页 |
| 7.2.3 牛CIDEC腺病毒的包装 | 第87-88页 |
| 7.2.4 腺病毒Ad-CIDEC滴度测定 | 第88-89页 |
| 7.2.5 牛原代脂肪细胞的培养 | 第89页 |
| 7.2.6 牛CIDEC、PPARg腺病毒感染牛原代脂肪细胞 | 第89页 |
| 7.2.7 牛CIDEC超表达效率的检测 | 第89-90页 |
| 7.2.8 牛CIDEC超表达对牛原代脂肪细胞有诱导细胞凋亡的作用 | 第90-91页 |
| 7.3 讨论 | 第91-92页 |
| 7.3.1 过表达CIDEC会诱导牛原代脂肪细胞凋亡 | 第91页 |
| 7.3.2 牛原代脂肪细胞分化过程中具有抗凋亡作用 | 第91-92页 |
| 7.4 小结 | 第92-93页 |
| 第八章 RNA干扰CIDEC对牛脂肪细胞的影响 | 第93-103页 |
| 8.1 材料与方法 | 第93-98页 |
| 8.1.1 牛CIDEC基因shRNA序列设计 | 第93-94页 |
| 8.1.2 pDsRed-N1-CIDEC载体的构建 | 第94页 |
| 8.1.3 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA载体构建 | 第94-96页 |
| 8.1.4 牛CIDEC有效shRNA筛选 | 第96页 |
| 8.1.5 牛pENTR/CMV-GFP/U6-CIDEC shRNA重组腺病毒构建 | 第96页 |
| 8.1.6 重组牛CIDEC基因shRNA腺病毒载体线性化 | 第96-97页 |
| 8.1.7 重组牛CIDEC基因shRNA腺病毒包装、扩增及最佳MOI确定 | 第97页 |
| 8.1.8 牛CIDEC对牛原代脂肪细胞脂质代谢相关基因的影响 | 第97-98页 |
| 8.1.9 统计分析 | 第98页 |
| 8.2 结果与分析 | 第98-101页 |
| 8.2.1 pDsRed-N1-CIDEC载体构建 | 第98页 |
| 8.2.2 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-CIDEC载体构建 | 第98页 |
| 8.2.3 牛CIDEC有效shRNA筛选 | 第98-99页 |
| 8.2.4 重组牛CIDEC基因shRNA腺病毒包装、扩增 | 第99页 |
| 8.2.5 腺病毒Ad-siCIDEC滴度测定 | 第99页 |
| 8.2.6 牛CIDEC干扰腺病毒感染牛原代脂肪细胞 | 第99-100页 |
| 8.2.7 牛CIDEC干扰效率 | 第100页 |
| 8.2.8 牛CIDEC干扰对牛原代脂肪细胞脂质代谢相关基因的影响 | 第100-101页 |
| 8.3 讨论 | 第101-102页 |
| 8.3.1 牛CIDEC参与糖脂代谢的调节 | 第101-102页 |
| 8.3.2 牛CIDEC参与线粒体活性调节 | 第102页 |
| 8.3.3 CIDEC与Perilipin促进脂解的机制不同 | 第102页 |
| 8.4 小结 | 第102-103页 |
| 第九章 结论与创新点 | 第103-104页 |
| 9.1 结论 | 第103页 |
| 9.2 创新点 | 第103-104页 |
| 参考文献 | 第104-117页 |
| 附录 | 第117-133页 |
| 致谢 | 第133-134页 |
| 作者简介 | 第134-135页 |
