| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第一章 研究背景及意义 | 第11-37页 |
| 1.1 研究背景 | 第11-36页 |
| 1.1.1 表观遗传与DNA甲基化概述 | 第11-12页 |
| 1.1.2 DNA甲基化的建立与维持 | 第12-13页 |
| 1.1.3 RNA干扰通路概述 | 第13-14页 |
| 1.1.4 植物RNA干扰通路核心蛋白 | 第14-18页 |
| 1.1.4.1 RDR蛋白 | 第14-15页 |
| 1.1.4.2 DCL蛋白 | 第15-16页 |
| 1.1.4.3 AGO蛋白 | 第16-18页 |
| 1.1.5 植物内源的sRNA | 第18-24页 |
| 1.1.5.1 植物中的miRNA | 第18-20页 |
| 1.1.5.2 植物中的hp-siRNA | 第20-21页 |
| 1.1.5.3 植物中的nat-siRNA | 第21-22页 |
| 1.1.5.4 植物中的secondary siRNA | 第22-24页 |
| 1.1.5.4.1 ta-siRNA和phasiRNA | 第22-23页 |
| 1.1.5.4.2 easiRNA | 第23-24页 |
| 1.1.5.5 植物中的hc-siRNA | 第24页 |
| 1.1.6 RNA介导的DNA甲基化通路 | 第24-30页 |
| 1.1.6.1 hc-siRNA的产生与沉默复合体的形成 | 第25-26页 |
| 1.1.6.2 沉默复合体介导的DNA甲基化的建立 | 第26-27页 |
| 1.1.6.3 RdDM通路的特异性 | 第27-28页 |
| 1.1.6.4 DNA甲基化与组蛋白修饰的关联 | 第28-30页 |
| 1.1.7 RNA聚合酶研究现状 | 第30-34页 |
| 1.1.7.1 依赖于DNA的RNA聚合酶简介 | 第30-31页 |
| 1.1.7.2 Pol Ⅱ的生存周期 | 第31-34页 |
| 1.1.7.2.1 PolⅡ亚基的细胞质内组装 | 第31-33页 |
| 1.1.7.2.2 Pol Ⅱ全酶复合物的入核转运 | 第33-34页 |
| 1.1.7.2.3 Pol Ⅱ全酶的分解与亚基的再循环 | 第34页 |
| 1.1.8 IYO与QQT2简介 | 第34-36页 |
| 1.1.8.1 IYO简介 | 第34-35页 |
| 1.1.8.2 QQT2简介 | 第35-36页 |
| 1.2 本研究的意义 | 第36-37页 |
| 第二章 实验材料与实验方法 | 第37-68页 |
| 2.1 实验材料 | 第37-39页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第37页 |
| 2.1.2 酶与生物化学试剂 | 第37-39页 |
| 2.1.2.1 植物培养 | 第37页 |
| 2.1.2.2 载体构建 | 第37页 |
| 2.1.2.3 基因组DNA提取 | 第37-38页 |
| 2.1.2.4 全基因组重测序 | 第38页 |
| 2.1.2.5 DNA甲基化分析 | 第38页 |
| 2.1.2.6 sRNA northern blot分析和sRNA克隆 | 第38页 |
| 2.1.2.7 RNA提取、反转录与荧光实时定量PCR | 第38页 |
| 2.1.2.8 免疫沉淀和western检测 | 第38页 |
| 2.1.2.9 其它化学试剂 | 第38-39页 |
| 2.2 实验方法 | 第39-68页 |
| 2.2.1 植物培养 | 第39页 |
| 2.2.1.1 培养土中拟南芥的培养 | 第39页 |
| 2.2.1.2 1/2 MS培养基中拟南芥的培养 | 第39页 |
| 2.2.2 突变体的筛选 | 第39-40页 |
| 2.2.2.1 pAGO4::GFP-AGO4转基因系的构建 | 第39-40页 |
| 2.2.2.2 EMS诱变及筛选 | 第40页 |
| 2.2.3 拟南芥T-DNA插入突变体基因型的鉴定 | 第40-41页 |
| 2.2.4 基于全基因组重测序的方法克隆突变体基因 | 第41-43页 |
| 2.2.4.1 拟南芥有性杂交 | 第41页 |
| 2.2.4.2 克隆群体的建立 | 第41页 |
| 2.2.4.3 基因组DNA的提取 | 第41页 |
| 2.2.4.4 全基因组重测序文库的建立 | 第41-42页 |
| 2.2.4.5 测序数据的分析及验证 | 第42-43页 |
| 2.2.5 载体构建 | 第43-46页 |
| 2.2.5.1 PCR扩增目的序列 | 第43页 |
| 2.2.5.2 PCR产物的琼脂糖凝胶纯化 | 第43页 |
| 2.2.5.3 酶切 | 第43-44页 |
| 2.2.5.4 连接 | 第44页 |
| 2.2.5.5 大肠杆菌热激转化 | 第44页 |
| 2.2.5.6 碱裂解法小量提取大肠杆菌质粒 | 第44-45页 |
| 2.2.5.7 TOPO克隆构建入门载体 | 第45页 |
| 2.2.5.8 基因的定点突变 | 第45页 |
| 2.2.5.9 LR重组反应 | 第45-46页 |
| 2.2.6 回补系和人工miRNA敲低系的建立 | 第46-47页 |
| 2.2.6.1 载体构建及农杆菌转化 | 第46页 |
| 2.2.6.2 农杆菌介导的拟南芥转基因 | 第46-47页 |
| 2.2.7 DNA甲基化检测 | 第47-50页 |
| 2.2.7.1 植物基因组DNA的提取 | 第47页 |
| 2.2.7.2 Chop-PCR检测DNA甲基化水平 | 第47-48页 |
| 2.2.7.3 全基因组甲基化测序 | 第48-50页 |
| 2.2.7.3.1 DNA破碎和末端修复 | 第48页 |
| 2.2.7.3.2 DNA样品的beads纯化 | 第48-49页 |
| 2.2.7.3.3 3’加A和接头连接 | 第49页 |
| 2.2.7.3.4 重亚硫酸氢盐处理基因组DNA | 第49-50页 |
| 2.2.7.3.5 PCR扩增 | 第50页 |
| 2.2.8 Western Blot检测蛋白表达 | 第50-51页 |
| 2.2.9 Real time PCR检测基因的表达 | 第51-53页 |
| 2.2.9.1 植物总RNA的提取 | 第51-52页 |
| 2.2.9.2 DNA酶消化总RNA中的DNA | 第52页 |
| 2.2.9.3 RNA反转录 | 第52-53页 |
| 2.2.9.4 荧光实时定量PCR | 第53页 |
| 2.2.10 小RNA水平检测与分析 | 第53-59页 |
| 2.2.10.1 PEG沉淀法富集植物小RNA | 第53-54页 |
| 2.2.10.2 Northern blot检测小RNA的表达 | 第54-56页 |
| 2.2.10.2.1 小RNA变性凝胶垂直板电泳分离 | 第54页 |
| 2.2.10.2.2 核酸半干法转膜 | 第54-55页 |
| 2.2.10.2.3 探针标记和杂交 | 第55页 |
| 2.2.10.2.4 洗膜和显影 | 第55-56页 |
| 2.2.10.3 小RNA的高通量测序文库的构建 | 第56-59页 |
| 2.2.10.3.1 小RNA的聚丙烯酰胺凝胶纯化 | 第56页 |
| 2.2.10.3.2 sRNA文库接头连接 | 第56-57页 |
| 2.2.10.3.3 sRNA文库反转录和PCR扩增 | 第57-59页 |
| 2.2.11 染色体免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP) | 第59-61页 |
| 2.2.11.1 材料准备 | 第59页 |
| 2.2.11.2 细胞核提取 | 第59页 |
| 2.2.11.3 超声 | 第59-60页 |
| 2.2.11.4 Pre-clear和IP | 第60页 |
| 2.2.11.5 Wash和洗脱 | 第60-61页 |
| 2.2.11.6 解交联 | 第61页 |
| 2.2.11.7 DNA纯化 | 第61页 |
| 2.2.12 蛋白的免疫纯化及质谱分析 | 第61-63页 |
| 2.2.12.1 免疫纯化 | 第61-62页 |
| 2.2.12.2 银染检测 | 第62-63页 |
| 2.2.12.3 质谱分析 | 第63页 |
| 2.2.13 原生质体中的免疫共沉淀 | 第63-65页 |
| 2.2.13.1 质粒粗提物的提取 | 第63页 |
| 2.2.13.2 氯化铯密度梯度离心与质粒纯化 | 第63-64页 |
| 2.2.13.3 原生质体制备和转化 | 第64-65页 |
| 2.2.13.4 免疫共沉淀 | 第65页 |
| 2.2.14 酵母双杂交验证蛋白相互作用 | 第65-66页 |
| 2.2.14.1 载体的构建 | 第65页 |
| 2.2.14.2 酵母感受态的制作 | 第65页 |
| 2.2.14.3 酵母的转化 | 第65-66页 |
| 2.2.14.4 相互作用的观察 | 第66页 |
| 2.2.15 蛋白的核质分离 | 第66页 |
| 2.2.16 生物信息学分析 | 第66-68页 |
| 2.2.16.1 sRNA分析流程 | 第66-67页 |
| 2.2.16.2 DNA甲基化分析流程 | 第67-68页 |
| 第三章 实验结果分析与讨论 | 第68-91页 |
| 3.1 实验结果分析 | 第68-87页 |
| 3.1.1 针对RdDM通路的遗传筛选体系的建立及突变体的筛选 | 第68-71页 |
| 3.1.2 das1、das2及das3突变体的分离与鉴定 | 第71-74页 |
| 3.1.3 IYO与QQT2在全基因组水平调节依赖于RdDM通路的DNA甲基化 | 第74-76页 |
| 3.1.4 iyo-4与qqt2-2对24-nt hc-siRNA的影响类似于nrpd1-3和nrpe1-11 | 第76页 |
| 3.1.5 IYO和QQT2的功能缺失影响Pol Ⅴ的转录活性 | 第76-77页 |
| 3.1.6 IYO和QQT2与Pol Ⅳ、Pol Ⅴ相互作用 | 第77-82页 |
| 3.1.7 Pol V的组装依赖于IYO和QQT2 | 第82-87页 |
| 3.2 讨论 | 第87-91页 |
| 参考文献 | 第91-105页 |
| 附录 | 第105-113页 |
| 附表一 缩略词对照 | 第105-108页 |
| 附件二 本研究所用到的引物序列 | 第108-113页 |
| 攻读博士期间发表的论文 | 第113-114页 |
| 致谢 | 第114-116页 |
