| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4页 |
| 第一章 非编码RNA种类及功能研究进展 | 第11-37页 |
| 1. 非编码RNA分类 | 第11-17页 |
| 1.1 LncRNA | 第12-13页 |
| 1.2 Secondary siRNA | 第13-16页 |
| 1.3 21U RNA | 第16-17页 |
| 2. 非编码RNA功能及功能机制 | 第17-28页 |
| 2.1 MiRNA | 第19-23页 |
| 2.1.1 MiRNA抑制靶基因mRNA翻译机制 | 第20-22页 |
| 2.1.2 MiRNA剪切靶基因mRNA机制 | 第22-23页 |
| 2.2 Secondary siRNA | 第23-26页 |
| 2.3 LncRNA | 第26-28页 |
| 3. 非编码RNA调控及机制 | 第28-33页 |
| 3.1 MiRNA的调控 | 第29-32页 |
| 3.1.1 甲基化标记 | 第29-30页 |
| 3.1.2 AGO参与的调控 | 第30页 |
| 3.1.3 Dicer参与的调控 | 第30-31页 |
| 3.1.4 Target参与的调控 | 第31页 |
| 3.1.5 LncRNA抑制miRNA功能 | 第31页 |
| 3.1.6 MiRNA对RNAi的调控 | 第31页 |
| 3.1.7 分子伴侣对miRNA功能的调控 | 第31-32页 |
| 3.2 Secondary siRNA的调控 | 第32页 |
| 3.2.1 甲基化 | 第32页 |
| 3.2.2 22G siRNA表达的启动 | 第32页 |
| 3.2.3 功能阶段的调控 | 第32页 |
| 3.3 LncRNA的调控 | 第32-33页 |
| 3.3.1 激素诱导 | 第32页 |
| 3.3.2 MiRNA调控 | 第32-33页 |
| 3.3.3 其他机制 | 第33页 |
| 4. 丝状真菌中非编码RNA研究进展 | 第33-35页 |
| 4.1 丝状真菌中小RNA产生机制 | 第33-34页 |
| 4.2 丝状真菌中小RNA参与的功能调控机制 | 第34-35页 |
| 4.2.1 丝状真菌中小RNA功能研究 | 第34-35页 |
| 4.2.2 丝状真菌中小RNA功能的调控 | 第35页 |
| 5. 非编码RNA的应用 | 第35页 |
| 6. 本论文研究意义 | 第35-37页 |
| 第二章 实验材料与实验方法 | 第37-69页 |
| 1. 实验材料 | 第37-40页 |
| 1.1 实验菌株和质粒 | 第37-38页 |
| 1.2 主要化学试剂 | 第38页 |
| 1.3 配制溶液和培养基 | 第38-39页 |
| 1.4 主要实验仪器 | 第39-40页 |
| 2. 实验方法 | 第40-69页 |
| 2.1 少孢节丛孢中小RNA验证 | 第40-47页 |
| 2.1.1 RT-PCR验证 | 第40-44页 |
| 2.1.1.1 小RNA提取 | 第40-41页 |
| 2.1.1.2 RNA消化 | 第41-42页 |
| 2.1.1.3 小RNA反转 | 第42-43页 |
| 2.1.1.4 PCR检测小RNA | 第43-44页 |
| 2.1.2 Northern blot验证 | 第44-47页 |
| 2.1.2.1 NE制备 | 第44-45页 |
| 2.1.2.2 捕器诱导 | 第45页 |
| 2.1.2.3 小RNA提取 | 第45页 |
| 2.1.2.4 15%PAGE-7 M Urea分离small RNA | 第45-46页 |
| 2.1.2.5 湿转法进行膜制备 | 第46页 |
| 2.1.2.6 Northern blot | 第46-47页 |
| 2.2 QDE-2的免疫共沉淀 | 第47-56页 |
| 2.2.1 Myc-tag载体构建 | 第47-52页 |
| 2.2.1.1 启动子+myc片段构建 | 第48-50页 |
| 2.2.1.2 基因区+终止子+hph抗性片段构建 | 第50-51页 |
| 2.2.1.3 Myc标签片段构建 | 第51-52页 |
| 2.2.2 原生质体转化 | 第52页 |
| 2.2.3 转化子PCR验证 | 第52-53页 |
| 2.2.3.1 转化子基因组提取(尿素法) | 第52页 |
| 2.2.3.2 PCR验证 | 第52-53页 |
| 2.2.4 转化子western blot验证myc-QDE-2 | 第53-54页 |
| 2.2.4.1 蛋白提取 | 第53页 |
| 2.2.4.2 蛋白浓度测定 | 第53-54页 |
| 2.2.4.3 Western blot | 第54页 |
| 2.2.5 IP验证 | 第54-56页 |
| 2.3 RIP-RT-PCR验证QDE-2绑定的milRNA | 第56-57页 |
| 2.3.1 免疫共沉淀产物RNA的提取 | 第56页 |
| 2.3.2 RNA消化 | 第56页 |
| 2.3.3 反转 | 第56页 |
| 2.3.4 RT-PCR检测milRNA | 第56-57页 |
| 2.3.5 Real time PCR检测milRNA | 第57页 |
| 2.4 MilR289靶基因确定 | 第57-64页 |
| 2.4.1 QDE-2 CLIP产物转录组测序即HITS-CLIP：High-ThroughputSequencing of RNAs from in vivo Cross-Linking andImmuno—Precipitation | 第58-59页 |
| 2.4.1.1 QDE-2 CLIP | 第58页 |
| 2.4.1.2 CLIP产物消化 | 第58页 |
| 2.4.1.3 测序文库构建 | 第58-59页 |
| 2.4.2 RT-PCR验证CLIP-deep-seq产物 | 第59-61页 |
| 2.4.2.1 RNA的免疫共沉淀 | 第59-60页 |
| 2.4.2.2 RNA消化 | 第60页 |
| 2.4.2.3 反转 | 第60页 |
| 2.4.2.4 PCR验证 | 第60-61页 |
| 2.4.3 烟草瞬时表达验证milR289候选靶基因 | 第61-64页 |
| 2.4.3.1 GFP+靶基因位点构建 | 第61-62页 |
| 2.4.3.2 MilR289前体构建 | 第62-63页 |
| 2.4.3.3 转化子验证 | 第63页 |
| 2.4.3.4 农杆菌GV3101转化 | 第63页 |
| 2.4.3.5 本氏烟草注射 | 第63-64页 |
| 2.4.3.6 Western blot验证 | 第64页 |
| 2.5 Qde-2敲除株表型实验 | 第64-69页 |
| 2.5.1 Qde-2敲除株southern blot验证 | 第64-67页 |
| 2.5.1.1 基因组提取 | 第64-65页 |
| 2.5.1.2 探针扩增 | 第65-66页 |
| 2.5.1.3 探针制备 | 第66页 |
| 2.5.1.4 Southern blot | 第66-67页 |
| 2.5.1.5 洗膜曝光 | 第67页 |
| 2.5.2 Qde-2敲除株urea诱导实验 | 第67页 |
| 2.5.3 Qde-2敲除株线虫提取液诱导实验 | 第67-68页 |
| 2.5.4 Qde-2敲除株线虫诱导实验 | 第68-69页 |
| 第三章 MilRNA验证 | 第69-75页 |
| 1. RT-PCR验证 | 第69-70页 |
| 2. Northern blot验证 | 第70-72页 |
| 3. 本章小结 | 第72页 |
| 4. 本章讨论 | 第72-75页 |
| 第四章 Myc标记QDE-2及RIP产物的milRNA检测 | 第75-83页 |
| 1. QDE-2免疫共沉淀 | 第75-79页 |
| 1.1 Myc标记载体构建 | 第75-77页 |
| 1.1.1 启动子+myc片段构建 | 第75-76页 |
| 1.1.2 基因区+终止子+hph抗性片段构建 | 第76-77页 |
| 1.1.3 Myc标签片段构建 | 第77页 |
| 1.2 少孢转化子验证 | 第77-79页 |
| 1.3 IP western blot验证 | 第79页 |
| 2. 检测RIP产物中的milRNA | 第79-81页 |
| 2.1 RT-PCR检测 | 第79-80页 |
| 2.2 Real time PCR检测 | 第80-81页 |
| 3. 本章小结 | 第81页 |
| 4. 本章讨论 | 第81-83页 |
| 第五章 MilR289靶基因确定 | 第83-91页 |
| 1. QDE-2 HITS-CLIP | 第83-84页 |
| 2. RT-PCR验证CLIP-deep-seq.产物 | 第84-85页 |
| 3. 烟草瞬时表达验证milR289候选靶基因 | 第85-88页 |
| 3.1 GFP+靶基因位点构建及milR289前体构建 | 第85-86页 |
| 3.2 GFP荧光表达的显微观察结果 | 第86-87页 |
| 3.3 Western blot验证注射结果 | 第87-88页 |
| 4. 本章小结 | 第88页 |
| 5. 本章讨论 | 第88-91页 |
| 第六章 QDE-2基因敲除表型 | 第91-96页 |
| 1. Qde-2敲除株southern blot验证 | 第91-92页 |
| 2. Qde-2敲除株urea诱导实验 | 第92页 |
| 3. Qde-2敲除株线虫提取液诱导实验 | 第92-93页 |
| 4. Qde-2敲除株线虫诱导实验 | 第93-94页 |
| 5. 本章小结 | 第94页 |
| 6. 本章讨论 | 第94-96页 |
| 第七章 全文总结与展望 | 第96-99页 |
| 参考文献 | 第99-104页 |
| 附录 | 第104-152页 |
| 附件1 | 第104-108页 |
| 附件2 | 第108-109页 |
| 附件3 | 第109-110页 |
| 附件4 | 第110-111页 |
| 附件5 | 第111-112页 |
| 附件6 | 第112-113页 |
| 附件7 | 第113-147页 |
| 附件8 | 第147-148页 |
| 附件9 | 第148-150页 |
| 附录10 | 第150-151页 |
| 附录11 | 第151-152页 |
| 致谢 | 第152-153页 |
