| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-37页 |
| 1.1 DNA双链断裂修复机制 | 第15-16页 |
| 1.2 基因组编辑技术 | 第16-25页 |
| 1.2.1 ZFN技术 | 第16-17页 |
| 1.2.2 TALEN技术 | 第17-18页 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas9技术 | 第18-25页 |
| 1.2.3.1 CRISPR系统的研究历史 | 第18-19页 |
| 1.2.3.2 CRISPR系统的结构 | 第19-21页 |
| 1.2.3.3 CRISPR系统的类型 | 第21页 |
| 1.2.3.4 细菌CRISPR/Cas9系统的免疫机制 | 第21-23页 |
| 1.2.3.5 利用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑技术的开发 | 第23-25页 |
| 1.3 CRISPR/CAS9技术的在动物基因组编辑研究中的应用 | 第25-31页 |
| 1.3.1 CRISPR/Cas9技术在人基因组编辑研究中的应用 | 第25-26页 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas9技术在小鼠基因组编辑研究中的应用 | 第26-27页 |
| 1.3.3 CRISPR/Cas9技术在大鼠基因组编辑研究中的应用 | 第27页 |
| 1.3.4 CRISPR/Cas9技术在灵长类动物基因组编辑研究中的应用 | 第27-28页 |
| 1.3.5 CRISPR/Cas9技术的在猪基因组编辑研究中的应用 | 第28-29页 |
| 1.3.6 CRISPR/Cas9技术的在羊基因组编辑研究中的应用 | 第29-30页 |
| 1.3.7 CRISPR/Cas9技术的在牛基因组编辑研究中的应用 | 第30页 |
| 1.3.8 CRISPR/Cas9技术在禽类基因组编辑研究中的应用 | 第30-31页 |
| 1.4 CRISPR/CAS9技术的脱靶效应 | 第31-33页 |
| 1.5 阳性细胞富集的报告载体系统 | 第33-35页 |
| 1.6 本研究的目的和意义 | 第35-37页 |
| 第二章 基于CRISPR/CAS9技术的鸡DF-1 细胞EDN3、ATP5E和OVA基因的高效敲除 | 第37-60页 |
| 2.1 试验材料 | 第37-38页 |
| 2.1.1 菌株，细胞系与质粒 | 第37页 |
| 2.1.2 主要试剂及试剂配制 | 第37-38页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第38页 |
| 2.1.4 引物序列 | 第38页 |
| 2.2 试验方法 | 第38-49页 |
| 2.2.1 CRISPR/Cas9表达载体构建 | 第38-42页 |
| 2.2.2 报告载体的构建 | 第42-45页 |
| 2.2.3 DF-1 细胞的培养和传代 | 第45页 |
| 2.2.4 DF-1 细胞的嘌呤霉素筛选的浓度的确定 | 第45页 |
| 2.2.5 细胞转染试验 | 第45-46页 |
| 2.2.6 DF-1 细胞嘌呤霉素的筛选 | 第46页 |
| 2.2.7 DF-1 细胞基因组的提取 | 第46页 |
| 2.2.8 DF-1 细胞基因组靶序列的扩增 | 第46-47页 |
| 2.2.9 T7E1突变检测 | 第47页 |
| 2.2.10 基因组突变的测序检测 | 第47-48页 |
| 2.2.11 脱靶效应检测 | 第48-49页 |
| 2.3 试验结果 | 第49-57页 |
| 2.3.1 CRISPR/Cas9表达载体构建 | 第49页 |
| 2.3.2 报告载体的构建 | 第49-50页 |
| 2.3.3 DF-1 细胞筛选的嘌呤霉素浓度确定 | 第50-51页 |
| 2.3.4 CRISPR/Cas9表达载体的活性检测 | 第51-52页 |
| 2.3.5 转染细胞的嘌呤霉素筛选 | 第52-53页 |
| 2.3.6 T7E1突变检测结果 | 第53-54页 |
| 2.3.7 基因组突变的测序检测结果 | 第54-56页 |
| 2.3.8 脱靶效应检测结果 | 第56-57页 |
| 2.4 讨论 | 第57-59页 |
| 2.5 小结 | 第59-60页 |
| 第三章 基于CRISPR/CAS9技术的猪肾原代成纤维细胞RELA基因的高效敲除 | 第60-74页 |
| 3.1 试验材料 | 第60-61页 |
| 3.1.1 菌株，细胞系，质粒 | 第60页 |
| 3.1.2 主要试剂及试剂配制 | 第60-61页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第61页 |
| 3.2 试验方法 | 第61-63页 |
| 3.2.1 靶向RELA基因的CRISPR/Cas9表达载体构建 | 第61页 |
| 3.2.2 报告载体的构建 | 第61-62页 |
| 3.2.3 细胞培养及转染 | 第62-63页 |
| 3.2.3.1 HEK293T细胞的培养及转染 | 第62页 |
| 3.2.3.2 猪肾原代成纤维细胞的分离培养 | 第62页 |
| 3.2.3.3 猪肾原代成纤维细胞的化学转染和电转条件摸索 | 第62-63页 |
| 3.2.4 电转猪肾原代成纤维细胞的嘌呤霉素筛选 | 第63页 |
| 3.2.5 PCR扩增靶序列及测序 | 第63页 |
| 3.3 试验结果 | 第63-72页 |
| 3.3.1 靶向RELA基因的CRISPR/Cas9表达载体构建 | 第63-64页 |
| 3.3.2 报告载体的构建 | 第64-65页 |
| 3.3.3 CRISPR/Cas9表达载体的活性检测 | 第65-66页 |
| 3.3.4 猪肾原代成纤维细胞的分离 | 第66页 |
| 3.3.5 猪肾原代成纤维细胞的电转条件优化 | 第66-69页 |
| 3.3.6 CRISPR/Cas9表达载体在猪肾原代成纤维细胞的活性检测 | 第69-70页 |
| 3.3.7 猪肾原代成纤维细胞的嘌呤霉素的细胞筛选 | 第70-71页 |
| 3.3.8 猪肾原代成纤维细胞的测序结果 | 第71-72页 |
| 3.4 讨论 | 第72-73页 |
| 3.5 小结 | 第73-74页 |
| 第四章 基于CRISPR/CAS9介导HR和SSA的两步法无缝编辑技术的开发 | 第74-93页 |
| 4.1 试验材料 | 第75页 |
| 4.1.1 菌株，细胞系与质粒 | 第75页 |
| 4.1.2 主要试剂及试剂配制 | 第75页 |
| 4.2 试验方法 | 第75-82页 |
| 4.2.1 CRISPR/Cas9表达载体的构建 | 第75-76页 |
| 4.2.2 供体载体CCR5.Donor的构建 | 第76-79页 |
| 4.2.2.1 载体JMB81-TK-P-G-A的构建 | 第78页 |
| 4.2.2.2 pXL-R-L的构建 | 第78-79页 |
| 4.2.2.3 供体CCR5-Donor的构建 | 第79页 |
| 4.2.3 第一次转染 | 第79页 |
| 4.2.4 抗嘌呤霉素阳性细胞的筛选 | 第79页 |
| 4.2.5 抗嘌呤霉素阳性细胞的PCR检测 | 第79-80页 |
| 4.2.6 抗嘌呤霉素阳性细胞的脱靶检测 | 第80-81页 |
| 4.2.7 第二次转染 | 第81页 |
| 4.2.8 抗GCV阳性细胞的筛选 | 第81页 |
| 4.2.9 抗GCV阳性克隆的PCR检测 | 第81页 |
| 4.2.10 抗GCV阳性克隆的脱靶检测 | 第81-82页 |
| 4.3 试验结果 | 第82-90页 |
| 4.3.1 CRISPR/Cas9表达载体的构建 | 第82页 |
| 4.3.2 供体载体CCR5.Donor的构建 | 第82-86页 |
| 4.3.3 HEK293T细胞的CCR5基因的第一次打靶 | 第86页 |
| 4.3.4 抗嘌呤霉素阳性克隆的PCR检测 | 第86-88页 |
| 4.3.5 抗嘌呤霉素克隆的脱靶效应检测 | 第88页 |
| 4.3.6 HEK293T细胞的第二次打靶 | 第88-89页 |
| 4.3.7 抗GCV克隆的PCR产物酶切和测序结果 | 第89-90页 |
| 4.3.8 克隆 2-3 的脱靶检测 | 第90页 |
| 4.4 讨论 | 第90-91页 |
| 4.5 小结 | 第91-93页 |
| 结论和创新点 | 第93-94页 |
| 参考文献 | 第94-103页 |
| 缩略词 | 第103-104页 |
| 致谢 | 第104-106页 |
| 作者简介 | 第106页 |
