| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一部分 氨基转移酶CrmG结构和功能研究 | 第10-54页 |
| 绪论 | 第10页 |
| 1 PLP依赖型酶及氨基转移酶家族概述 | 第10-22页 |
| 1.1 PLP依赖型酶概述 | 第10-14页 |
| 1.1.1 PLP概述 | 第10-11页 |
| 1.1.2 PLP依赖型酶概述 | 第11-13页 |
| 1.1.3 PLP依赖型酶的分类 | 第13-14页 |
| 1.2 氨基转移酶家族蛋白概述 | 第14-15页 |
| 1.2.1 氨基转移酶概述 | 第14页 |
| 1.2.2 天冬氨酸氨基转移酶家族 | 第14-15页 |
| 1.3 海洋类抗生素及浅蓝霉素概述 | 第15-17页 |
| 1.3.1 浅蓝霉素概述 | 第16页 |
| 1.3.2 浅蓝霉素A的发现及功能 | 第16-17页 |
| 1.4 氨基转移酶CrmG研究背景及进展 | 第17-22页 |
| 2 实验材料和方法 | 第22-32页 |
| 2.1 实验材料 | 第22-23页 |
| 2.1.1 质粒和菌株 | 第22页 |
| 2.1.2 试剂 | 第22页 |
| 2.1.3 仪器和耗材 | 第22-23页 |
| 2.2 实验方法 | 第23-32页 |
| 2.2.1 表达质粒的构建 | 第23页 |
| 2.2.1.1 引物设计 | 第23页 |
| 2.2.1.2 表达菌株的选择 | 第23页 |
| 2.2.2 目的蛋白的表达和纯化 | 第23-25页 |
| 2.2.2.1 小量表达检测 | 第23-24页 |
| 2.2.2.2 目的蛋白的大量表达 | 第24页 |
| 2.2.2.3 目的蛋白的纯化及浓度测定 | 第24-25页 |
| 2.2.3 氨基转移酶CrmG蛋白质均一性检测 | 第25-27页 |
| 2.2.3.1 非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测蛋白在溶液中的均一性 | 第25-26页 |
| 2.2.3.2 动态光散射检测蛋白在溶液中的均一性 | 第26-27页 |
| 2.2.4 氨基转移酶CrmG蛋白结晶条件的筛选和优化 | 第27-29页 |
| 2.2.4.1 蛋白结晶基本原理 | 第27页 |
| 2.2.4.2 野生型蛋白结晶条件筛选 | 第27页 |
| 2.2.4.3 野生型蛋白结晶条件优化 | 第27-28页 |
| 2.2.4.4 CrmG酶与其辅因子PLP复合物共结晶条件筛选 | 第28页 |
| 2.2.4.5 CrmG酶与其辅因子PLP共结晶条件优化 | 第28-29页 |
| 2.2.5 野生型蛋白CrmG晶体与CrmG和Glu复合物共结晶蛋白晶体数据收集及解析 | 第29-30页 |
| 2.2.6 蛋白稳定性检测及结构分析 | 第30页 |
| 2.2.6.1 N-端测序 | 第30页 |
| 2.2.6.2 精确分子量测定 | 第30页 |
| 2.2.7 定点突变实验及酶活功能验证 | 第30-32页 |
| 2.2.7.1 定点突变实验 | 第30-31页 |
| 2.2.7.2 突变株表达 | 第31页 |
| 2.2.7.3 酶活功能验证 | 第31-32页 |
| 3 实验结果和结论 | 第32-48页 |
| 3.1 实验结果 | 第32-47页 |
| 3.1.1 目的蛋白的纯化 | 第32-34页 |
| 3.1.1.1 野生型CrmG蛋白的纯化 | 第32-34页 |
| 3.1.1.2 加入辅因子PLP的CrmG蛋白的纯化 | 第34页 |
| 3.1.2 目的蛋白的动态光散射检测及Native-PAGE分析 | 第34-36页 |
| 3.1.2.1 目的蛋白Native-PAGE检测 | 第34-35页 |
| 3.1.2.2 目的蛋白的动态光散射结果 | 第35-36页 |
| 3.1.3 目的蛋白的晶体生长 | 第36-38页 |
| 3.1.3.1 CrmG蛋白apo状态的结晶 | 第36-37页 |
| 3.1.3.2 CrmG与PLP和Glu在类似apo条件下的共结晶 | 第37页 |
| 3.1.3.3 CrmG与PLP共结晶 | 第37-38页 |
| 3.1.4 目的蛋白晶体的X-Ray衍射数据收集及解析 | 第38-39页 |
| 3.1.4.1 目的蛋白晶体的X-Ray衍射数据收集 | 第38页 |
| 3.1.4.2 目的蛋白晶体的X-Ray衍射数据解析 | 第38-39页 |
| 3.1.5 蛋白结构分析 | 第39页 |
| 3.1.6 蛋白的稳定性检测 | 第39-42页 |
| 3.1.6.1 N-端测序 | 第40页 |
| 3.1.6.2 精确分子量测定 | 第40-42页 |
| 3.1.7 同源家族蛋白比对分析 | 第42-43页 |
| 3.1.8 蛋白自身相互作用及与家族蛋白多聚体比较分析 | 第43-45页 |
| 3.1.9 酶活定点突变实验及活性检测 | 第45-47页 |
| 3.2 实验结论 | 第47-48页 |
| 参考文献 | 第48-54页 |
| 第二部分 人源SNX7蛋白的结构和性质研究 | 第54-72页 |
| 绪论 | 第54页 |
| 4 Sorting nexins家族蛋白 | 第54-58页 |
| 4.1 Sorting nexins家族蛋白分类 | 第54-55页 |
| 4.2 Sorting nexins家族蛋白功能 | 第55-56页 |
| 4.3 Sorting nexins7研究进展 | 第56-58页 |
| 5 实验材料与方法 | 第58-62页 |
| 5.1 实验材料 | 第58页 |
| 5.2 实验试剂和器材 | 第58页 |
| 5.3 实验方法 | 第58-62页 |
| 5.3.1 目的基因表达载体的构建 | 第58-59页 |
| 5.3.2 目的蛋白的表达 | 第59页 |
| 5.3.3 目的蛋白的纯化 | 第59-60页 |
| 5.3.4 目的蛋白的Western-Blotting分析 | 第60页 |
| 5.3.5 目的蛋白动态光散射实验 | 第60页 |
| 5.3.6 目的蛋白与多种磷脂膜PIPStrips结合实验检测 | 第60-62页 |
| 6 实验结果与结论 | 第62-68页 |
| 6.1 实验结果 | 第62-67页 |
| 6.1.1 目的基因表达载体构建 | 第62页 |
| 6.1.2 目的蛋白SNX7~(PX-BAR)的成功表达 | 第62页 |
| 6.1.3 目的蛋白的纯化 | 第62-64页 |
| 6.1.3.1 Ni-NTA亲和层析 | 第62-63页 |
| 6.1.3.2 离子交换柱QFF纯化 | 第63页 |
| 6.1.3.3 分子筛纯化 | 第63-64页 |
| 6.1.4 目的蛋白Western-Blotting检测和动态光均一性检测 | 第64-65页 |
| 6.1.4.1 Western-Blotting检测 | 第64-65页 |
| 6.1.4.2 目的蛋白SNX7~(PX-BAR)的动态光均一性检测 | 第65页 |
| 6.1.5 目的蛋白SNX7~(PX-BAR)与磷脂膜PIPStrips结合特异性分析 | 第65-67页 |
| 6.2 结论 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-72页 |
| 附录 | 第72-78页 |
| 一、常用缓冲液、试剂的配制 | 第72-76页 |
| 1 核酸电泳相关缓冲液 | 第72页 |
| 2 蛋白电泳相关缓冲液及试剂 | 第72-74页 |
| 3 实验室常用试剂 | 第74-75页 |
| 4 SDS-PAGE凝胶的配制 | 第75-76页 |
| 二、培养基的配制 | 第76-77页 |
| 1 常用大肠杆菌培养基 | 第76页 |
| 2 Se-Met蛋白衍生物制备所需培养基 | 第76-77页 |
| 三、pET-28a表达载体图谱 | 第77-78页 |
| 致谢 | 第78-79页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录 | 第79页 |
