| 摘要 | 第6-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 缩略词 | 第19-20页 |
| 第一章 引言 | 第20-35页 |
| 1.1 真菌漆酶的生物学性质 | 第20-23页 |
| 1.1.1 漆酶的结构 | 第20页 |
| 1.1.2 漆酶的催化机理 | 第20-21页 |
| 1.1.3 漆酶的理化性质 | 第21-23页 |
| 1.1.3.1 温度 | 第21-22页 |
| 1.1.3.2 pH | 第22页 |
| 1.1.3.3 金属离子对漆酶酶活的影响 | 第22-23页 |
| 1.2 漆酶基因 | 第23-27页 |
| 1.2.1 漆酶基因的克隆 | 第23页 |
| 1.2.2 漆酶基因家族 | 第23-25页 |
| 1.2.3 漆酶基因的5'端上游调控区 | 第25-27页 |
| 1.3 真菌漆酶的异源表达 | 第27-29页 |
| 1.3.1 真菌漆酶在酵母中的表达 | 第27-29页 |
| 1.3.1.1 酵母表达系统 | 第27-28页 |
| 1.3.1.2 真菌漆酶在酵母中表达的影响因素 | 第28-29页 |
| 1.3.2 真菌漆酶在丝状真菌中的表达 | 第29页 |
| 1.4 漆酶的应用 | 第29-33页 |
| 1.4.1 纸浆和造纸工业 | 第29-30页 |
| 1.4.2 纺织和染料工业 | 第30-31页 |
| 1.4.3 生物修复 | 第31-32页 |
| 1.4.4 生物合成 | 第32页 |
| 1.4.5 食品工业 | 第32-33页 |
| 1.5 本论文研究的意义及内容 | 第33-35页 |
| 1.5.1 研究意义 | 第33页 |
| 1.5.2 研究内容 | 第33-35页 |
| 第二章 T.trogii S0301漆酶同工酶的克隆及其表达分析 | 第35-53页 |
| 2.1 材料与方法 | 第35-41页 |
| 2.1.1 菌株与载体 | 第35页 |
| 2.1.1.1 菌株 | 第35页 |
| 2.1.1.2 质粒 | 第35页 |
| 2.1.2 试剂 | 第35页 |
| 2.1.3 培养基 | 第35-36页 |
| 2.1.4 菌种培养 | 第36页 |
| 2.1.4.1 菌种活化 | 第36页 |
| 2.1.4.2 漆酶诱导 | 第36页 |
| 2.1.5 引物设计 | 第36-37页 |
| 2.1.6 基因组DNA的提取 | 第37-38页 |
| 2.1.7 漆酶同工酶基因的克隆 | 第38-39页 |
| 2.1.7.1 漆酶同工酶铜结合保守区片段的克隆 | 第38页 |
| 2.1.7.2 pMD19-T连接 | 第38页 |
| 2.1.7.3 大肠杆菌转化及重组子筛选 | 第38-39页 |
| 2.1.7.4 阳性重组子验证 | 第39页 |
| 2.1.8 RFLP | 第39页 |
| 2.1.9 三磷酸甘油醛脱氢酶基因部分序列的克隆 | 第39页 |
| 2.1.10 Total-RNA的制备 | 第39-40页 |
| 2.1.10.1 试剂和器具处理 | 第39-40页 |
| 2.1.10.2 Total-RNA的提取 | 第40页 |
| 2.1.11 cDNA第一链的合成 | 第40页 |
| 2.1.12 漆酶同工酶qRT-PCR | 第40页 |
| 2.1.13 漆酶基因的生物信息学分析 | 第40-41页 |
| 2.2 结果 | 第41-50页 |
| 2.2.1 漆酶同工酶的克隆及鉴定 | 第41-42页 |
| 2.2.2 漆酶同工酶基因结构分析 | 第42-44页 |
| 2.2.3 漆酶同工酶氨基酸序列分析 | 第44-46页 |
| 2.2.4 gpd基因部分序列的克隆 | 第46-47页 |
| 2.2.5 温度及铜离子对漆酶同工酶表达的影响 | 第47-50页 |
| 2.3 讨论 | 第50-52页 |
| 2.4 小结 | 第52-53页 |
| 第三章 漆酶基因全长的克隆及序列分析 | 第53-65页 |
| 3.1 材料与方法 | 第53-56页 |
| 3.1.1 菌株与载体 | 第53页 |
| 3.1.1.1 菌株 | 第53页 |
| 3.1.1.2 质粒 | 第53页 |
| 3.1.2 试剂 | 第53页 |
| 3.1.3 培养基 | 第53页 |
| 3.1.4 引物设计 | 第53-55页 |
| 3.1.5 基因组DNA的提取 | 第55页 |
| 3.1.6 漆酶基因的克隆 | 第55页 |
| 3.1.6.1 漆酶铜结合保守区(CuⅠ-CuⅣ)两侧序列扩增 | 第55页 |
| 3.1.6.2 lac13转录调控区序列扩增 | 第55页 |
| 3.1.7 漆酶基因的生物信息学分析 | 第55-56页 |
| 3.2. 结果 | 第56-62页 |
| 3.2.1 漆酶全长基因及上游调控区部分序列的克隆 | 第56-57页 |
| 3.2.2 漆酶基因结构及氨基酸序列分析 | 第57-59页 |
| 3.2.3 漆酶基因5'端上游调控区序列分析 | 第59-62页 |
| 3.3 讨论 | 第62-64页 |
| 3.4 小结 | 第64-65页 |
| 第四章 耐热漆酶的纯化及脱色应用 | 第65-78页 |
| 4.1 材料与方法 | 第65-69页 |
| 4.1.1 菌株 | 第65页 |
| 4.1.2 试剂 | 第65页 |
| 4.1.3 培养基 | 第65页 |
| 4.1.4 漆酶诱导 | 第65页 |
| 4.1.5 漆酶纯化 | 第65-66页 |
| 4.1.6 漆酶酶活及蛋白浓度测定 | 第66-67页 |
| 4.1.6.1 漆酶酶活测定 | 第66-67页 |
| 4.1.6.2 蛋白浓度测定 | 第67页 |
| 4.1.7 纯化漆酶酶谱检测 | 第67-68页 |
| 4.1.8 纯化漆酶特性分析 | 第68-69页 |
| 4.1.8.1 纯化漆酶的最适温度、热稳定性和特定温度半衰期测定 | 第68页 |
| 4.1.8.2 纯化漆酶的最适pH和pH稳定性测定 | 第68页 |
| 4.1.8.3 纯化漆酶动力学特性分析 | 第68-69页 |
| 4.1.9 金属离子对纯化漆酶酶活的影响 | 第69页 |
| 4.1.10 脱色 | 第69页 |
| 4.1.11 纯化漆酶肽指纹图谱 | 第69页 |
| 4.2 结果 | 第69-74页 |
| 4.2.1 漆酶纯化 | 第69-70页 |
| 4.2.2 纯漆酶的特性分析 | 第70-71页 |
| 4.2.3 金属离子对纯化漆酶酶活性的影响 | 第71页 |
| 4.2.4 染料脱色 | 第71-74页 |
| 4.2.5 纯化漆酶的肽指纹分析 | 第74页 |
| 4.3 讨论 | 第74-76页 |
| 4.4 小结 | 第76-78页 |
| 第五章 耐热漆酶基因的异源表达 | 第78-90页 |
| 5.1 材料与方法 | 第78-85页 |
| 5.1.1 菌株与载体 | 第78页 |
| 5.1.1.1 菌株 | 第78页 |
| 5.1.1.2 质粒 | 第78页 |
| 5.1.2 试剂 | 第78页 |
| 5.1.3 培养基 | 第78-79页 |
| 5.1.4 引物设计 | 第79页 |
| 5.1.5 重组表达载体的构建及鉴定 | 第79-82页 |
| 5.1.5.1 cDNA的克隆 | 第80-81页 |
| 5.1.5.2 EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切 | 第81页 |
| 5.1.5.3 cDNA与pPIC9k连接 | 第81-82页 |
| 5.1.5.4 重组表达载体的鉴定 | 第82页 |
| 5.1.6 电转化 | 第82-83页 |
| 5.1.6.1 重组表达载体线性化 | 第82页 |
| 5.1.6.2 酵母感受态细胞的制备 | 第82页 |
| 5.1.6.3 转化 | 第82-83页 |
| 5.1.7 阳性重组子的筛选 | 第83页 |
| 5.1.8 重组子的分子鉴定 | 第83-84页 |
| 5.1.8.1 酵母基因组提取 | 第83-84页 |
| 5.1.8.2 重组漆酶的克隆 | 第84页 |
| 5.1.9 重组漆酶的诱导 | 第84页 |
| 5.1.10 重组漆酶酶活检测 | 第84-85页 |
| 5.1.10.1 ABTS平板检测 | 第84页 |
| 5.1.10.2 ABTS液体检测 | 第84-85页 |
| 5.2 结果 | 第85-88页 |
| 5.2.1 重组表达载体的构建及鉴定 | 第85页 |
| 5.2.2 重组酵母的筛选及分子鉴定 | 第85-87页 |
| 5.2.3 重组漆酶的酶活检测 | 第87-88页 |
| 5.3 讨论 | 第88-89页 |
| 5.4 小结 | 第89-90页 |
| 第六章 结论与展望 | 第90-94页 |
| 6.1 结论 | 第90-92页 |
| 6.2 展望 | 第92-94页 |
| 致谢 | 第94-95页 |
| 参考文献 | 第95-104页 |
| 附录 | 第104页 |
