| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 1 引言 | 第13-23页 |
| 1.1 虫生真菌的研究与应用现状 | 第13-17页 |
| 1.1.1 虫生真菌侵染寄主过程 | 第13-15页 |
| 1.1.2 蜡蚧菌、座壳孢在害虫防治中的应用 | 第15-17页 |
| 1.2 虫生真菌毒力改良的研究现状 | 第17-21页 |
| 1.2.1 标记基因 | 第17页 |
| 1.2.2 遗传转化方法 | 第17-18页 |
| 1.2.3 相关增效基因的研究 | 第18-19页 |
| 1.2.4 蜘蛛毒素的应用 | 第19-20页 |
| 1.2.5 转化菌株遗传稳定性验证 | 第20-21页 |
| 1.3 研究目的与意义 | 第21-22页 |
| 1.4 研究内容 | 第22-23页 |
| 1.4.1 优势寄主的分离鉴定 | 第22页 |
| 1.4.2 蜘蛛毒素基因Ar1a的合成、扩增及表达载体的构建 | 第22页 |
| 1.4.3 转化蜡蚧菌 | 第22页 |
| 1.4.4 转化子的筛选验证及遗传稳定性分析 | 第22-23页 |
| 1.4.5 转化子的生物活性测定 | 第23页 |
| 1.5 技术路线图 | 第23页 |
| 2 材料与方法 | 第23-44页 |
| 2.1 实验材料 | 第23-27页 |
| 2.1.1 供试菌株及质粒 | 第23-24页 |
| 2.1.2 工具酶及试剂 | 第24页 |
| 2.1.3 常用培养基及试剂 | 第24-26页 |
| 2.1.4 实验仪器 | 第26页 |
| 2.1.5 引物 | 第26-27页 |
| 2.1.6 供试昆虫及材料 | 第27页 |
| 2.2 试验方法 | 第27-33页 |
| 2.2.1 真菌DNA的提取 | 第27-28页 |
| 2.2.2 真菌RNA的提取 | 第28页 |
| 2.2.3 反转录cDNA第一链的合成 | 第28-29页 |
| 2.2.4 目的片段分离回收 | 第29-30页 |
| 2.2.5 质粒DNA的小量提取 | 第30-31页 |
| 2.2.6 ω-ACTX-Ar1a基因的人工合成 | 第31页 |
| 2.2.7 毒素基因的扩增 | 第31-32页 |
| 2.2.8 启动子、终止子基因克隆 | 第32-33页 |
| 2.3 表达载体的构建 | 第33-38页 |
| 2.3.1 载体构建示意图 | 第33-34页 |
| 2.3.2 目的基因的连接 | 第34-36页 |
| 2.3.3 连接产物的转化 | 第36-37页 |
| 2.3.4 构建重组质粒 | 第37-38页 |
| 2.4 农杆菌介导的蜡蚧菌的转化 | 第38-40页 |
| 2.4.1 农杆菌AGL-1 感受态的制备 | 第38-39页 |
| 2.4.2 冻融法转化农杆菌 | 第39页 |
| 2.4.3 农杆菌AGL-1 的诱导培养 | 第39页 |
| 2.4.4 蜡蚧菌CA-14 分生孢子的培养 | 第39-40页 |
| 2.4.5 农杆菌转化蜡蚧轮枝菌 | 第40页 |
| 2.5 转化菌株的验证 | 第40-43页 |
| 2.5.1 假定转化子的单孢分离 | 第40页 |
| 2.5.2 转化子DNA水平的验证 | 第40-41页 |
| 2.5.3 遗传稳定性鉴定 | 第41页 |
| 2.5.4 转化子拷贝数验证 | 第41-43页 |
| 2.5.5 转化子表达量的测定 | 第43页 |
| 2.6 毒力测定试验方法 | 第43-44页 |
| 2.6.1 供试菌株 | 第43页 |
| 2.6.2 孢子悬浮液的制备 | 第43-44页 |
| 2.6.3 试虫的处理 | 第44页 |
| 2.6.4 转化菌株的毒力测定 | 第44页 |
| 3 结果与分析 | 第44-66页 |
| 3.1 优势寄生菌的分离与鉴定 | 第44-47页 |
| 3.1.1 蜡蚧菌CA-14 的鉴定 | 第44-45页 |
| 3.1.2 座壳孢的鉴定 | 第45-47页 |
| 3.2 目的基因的克隆 | 第47-49页 |
| 3.2.1 毒素基因Ar1a的扩增 | 第47页 |
| 3.2.2 启动子终止子的扩增 | 第47-49页 |
| 3.3 表达载体的构建 | 第49-51页 |
| 3.3.1 ω-ACTX-Ar1a基因与PtrpC启动子的连接 | 第49-50页 |
| 3.3.2 ω-ACTX-Ar1a基因与启动子和终止子的连接 | 第50-51页 |
| 3.4 重组质粒的构建 | 第51-53页 |
| 3.5 农杆菌介导的蜡蚧菌 | 第53-55页 |
| 3.5.1 农杆菌转化 | 第53-54页 |
| 3.5.2 蜡蚧菌的转化 | 第54-55页 |
| 3.6 转化菌株的验证及遗传稳定性分析 | 第55-63页 |
| 3.6.1 转化子DNA验证 | 第55-57页 |
| 3.6.2 遗传稳定性验证 | 第57-58页 |
| 3.6.3 转化子RNA验证 | 第58-60页 |
| 3.6.4 转化子拷贝数测定 | 第60-63页 |
| 3.7 转化菌株的毒力测定 | 第63-66页 |
| 4 结论与讨论 | 第66-70页 |
| 4.1 全文结论 | 第66-67页 |
| 4.1.1 目的基因的克隆 | 第66页 |
| 4.1.2 表达载体的构建 | 第66页 |
| 4.1.3 蜡蚧菌的转化及验证 | 第66页 |
| 4.1.4 蜡蚧菌转化子毒力测定 | 第66-67页 |
| 4.2 讨论 | 第67-70页 |
| 创新点 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-79页 |
| 附录 | 第79-80页 |
| 致谢 | 第80页 |
