| 摘要 | 第5-7页 |
| abstract | 第7-9页 |
| 英文缩略表 | 第16-17页 |
| 第一章 引言 | 第17-29页 |
| 1.1 弓形虫及弓形虫病概述 | 第17-19页 |
| 1.2 弓形虫的基因编辑 | 第19-25页 |
| 1.2.1 应用于弓形虫的基因筛选标记 | 第19-20页 |
| 1.2.2 应用于弓形虫的正向遗传操作工具 | 第20-21页 |
| 1.2.3 应用于弓形虫的传统反向遗传操作工具 | 第21页 |
| 1.2.4 研究弓形虫必需基因的遗传工具 | 第21-24页 |
| 1.2.5 CRISPR-Cas9介导的弓形虫基因编辑 | 第24页 |
| 1.2.6 CRISPR-Cas9在弓形虫基因功能研究中的应用 | 第24-25页 |
| 1.3 弓形虫钙依赖性蛋白激酶的研究进展 | 第25-28页 |
| 1.3.1 弓形虫CDPKs的结构与进化 | 第25-27页 |
| 1.3.2 已知的弓形虫CDPKs的生物学功能 | 第27-28页 |
| 1.4 总结与展望 | 第28-29页 |
| 第二章 弓形虫钙依赖性蛋白激酶的表达谱研究 | 第29-41页 |
| 2.1 材料与方法 | 第29-34页 |
| 2.1.1 虫株及细胞 | 第29页 |
| 2.1.2 主要仪器与试剂 | 第29-30页 |
| 2.1.3 样品处理及收集 | 第30页 |
| 2.1.4 弓形虫速殖子总RNA抽提 | 第30-31页 |
| 2.1.5 总RNA纯度和完整性检测 | 第31页 |
| 2.1.6 逆转录PCR | 第31-32页 |
| 2.1.7 荧光定量PCR | 第32-34页 |
| 2.1.8 弓形虫CDPKs不同时期的表达 | 第34页 |
| 2.2 结果 | 第34-39页 |
| 2.2.1 弓形虫速殖子总mRNA的质量检测 | 第34页 |
| 2.2.2 CDPKs在酸性条件下的表达 | 第34-35页 |
| 2.2.3 CDPKs在碱性条件下的表达 | 第35-36页 |
| 2.2.4 CDPKs在高温条件下的表达 | 第36-37页 |
| 2.2.5 CDPKs在低温条件下的表达 | 第37页 |
| 2.2.6 CDPKs在弓形虫细胞内分裂周期的表达 | 第37页 |
| 2.2.7 CDPKs在弓形虫不同发育时期的表达 | 第37-38页 |
| 2.2.8 CDPKs在弓形虫不同入侵阶段的表达 | 第38-39页 |
| 2.2.9 IFN-γ对CDPKs表达量的影响 | 第39页 |
| 2.3 讨论 | 第39-41页 |
| 第三章 六个弓形虫CDPKs敲除虫株的构建和表型分析 | 第41-58页 |
| 3.1 材料与方法 | 第41-49页 |
| 3.1.0 实验动物、质粒和细胞 | 第41页 |
| 3.1.1 仪器设备和试剂 | 第41-42页 |
| 3.1.2 主要溶液的配置 | 第42页 |
| 3.1.3 敲除质粒的构建 | 第42-44页 |
| 3.1.4 抗性标记的扩增 | 第44页 |
| 3.1.5 CDPKs缺失株的构建 | 第44-45页 |
| 3.1.6 PCR筛选阳性单克隆 | 第45页 |
| 3.1.7 多克隆抗体的制备与检测 | 第45-46页 |
| 3.1.8 间接免疫荧光（IFA）鉴定PCR阳性虫株 | 第46-47页 |
| 3.1.9 噬斑实验 | 第47页 |
| 3.1.10 入侵实验 | 第47-48页 |
| 3.1.11 逸出实验 | 第48页 |
| 3.1.12 胞内增殖实验 | 第48页 |
| 3.1.13 小鼠体内毒理试验 | 第48页 |
| 3.1.14 统计学分析 | 第48-49页 |
| 3.2 结果与分析 | 第49-56页 |
| 3.2.1 CDPKs敲除质粒 | 第49-50页 |
| 3.2.2 DHFR抗性片段的扩增 | 第50-51页 |
| 3.2.3 多抗效价检测 | 第51页 |
| 3.2.4 单克隆缺失株的构建及筛选 | 第51页 |
| 3.2.5 单克隆虫株的PCR鉴定 | 第51-52页 |
| 3.2.6 单克隆虫株的IFA鉴定 | 第52页 |
| 3.2.7 噬斑实验 | 第52-53页 |
| 3.2.8 入侵实验 | 第53-54页 |
| 3.2.9 逸出实验 | 第54-55页 |
| 3.2.10 胞内增殖实验 | 第55页 |
| 3.2.11 小鼠毒力实验 | 第55-56页 |
| 3.3 讨论 | 第56-58页 |
| 第四章 弓形虫CDPK双缺失株的构建和表型分析 | 第58-69页 |
| 4.1 材料与方法 | 第58-61页 |
| 4.1.1 虫株与实验动物 | 第58页 |
| 4.1.2 主要仪器与试剂 | 第58页 |
| 4.1.3 主要溶液的培置 | 第58页 |
| 4.1.4 敲除质粒及溶液培置 | 第58-59页 |
| 4.1.5 Ble抗性基因的扩增 | 第59页 |
| 4.1.6 CDPKs双缺失株的构建 | 第59-60页 |
| 4.1.7 PCR筛选阳性单克隆 | 第60页 |
| 4.1.8 IFA鉴定PCR阳性单克隆 | 第60页 |
| 4.1.9 噬斑实验 | 第60页 |
| 4.1.10 入侵实验 | 第60页 |
| 4.1.11 逸出实验 | 第60页 |
| 4.1.12 胞内增殖实验 | 第60页 |
| 4.1.13 小鼠体内毒力试验 | 第60-61页 |
| 4.1.14 统计学分析 | 第61页 |
| 4.2 结果与分析 | 第61-67页 |
| 4.2.1 Ble抗性片段的扩增 | 第61页 |
| 4.2.2 CDPK双缺失株单克隆筛选 | 第61-62页 |
| 4.2.3 单克隆虫株的PCR鉴定 | 第62页 |
| 4.2.4 单克隆虫株的IFA鉴定 | 第62-63页 |
| 4.2.5 噬斑实验 | 第63-64页 |
| 4.2.6 入侵实验 | 第64-65页 |
| 4.2.7 逸出实验 | 第65-66页 |
| 4.2.8 胞内增殖实验 | 第66-67页 |
| 4.2.9 小鼠毒力实验 | 第67页 |
| 4.3 讨论 | 第67-69页 |
| 第五章 弓形虫钙依赖性蛋白激酶2核酸疫苗的研究 | 第69-83页 |
| 5.1 材料与方法 | 第69-74页 |
| 5.1.1 虫株、细胞与实验动物 | 第69页 |
| 5.1.2 主要仪器与试剂 | 第69-70页 |
| 5.1.3 弓形虫总RNA的提取 | 第70页 |
| 5.1.4 CDPK2基因编码区序列扩增 | 第70-71页 |
| 5.1.5 载体及目的片段的回收与连接 | 第71页 |
| 5.1.6 小量提取无内毒素重组质粒 | 第71-72页 |
| 5.1.7 重组质粒转染HEK293T细胞 | 第72页 |
| 5.1.8 间接免疫荧光（IFA）检测弓形虫CDPK2蛋白的表达 | 第72页 |
| 5.1.9 质粒的大量提取与测定 | 第72页 |
| 5.1.10 小鼠免疫试验 | 第72-73页 |
| 5.1.11 脾细胞悬液的制备 | 第73页 |
| 5.1.12 免疫效果的评价 | 第73-74页 |
| 5.1.13 统计学分析 | 第74页 |
| 5.2 结果 | 第74-81页 |
| 5.2.1 弓形虫CDPK2基因编码区序列扩增 | 第74-75页 |
| 5.2.2 pVAX-CDPK2重组质粒的构建及酶切鉴定 | 第75-76页 |
| 5.2.3 间接免疫荧光检测pVAX-CDPK2载体的表达 | 第76-77页 |
| 5.2.4 血清中IgG抗体和IgG1、IgG2a抗体亚类的检测 | 第77-79页 |
| 5.2.5 脾淋巴细胞增殖实验 | 第79页 |
| 5.2.6 流式细胞术分析脾淋巴细胞亚群 | 第79页 |
| 5.2.7 免疫小鼠细胞因子的检测 | 第79-80页 |
| 5.2.8 攻虫感染实验 | 第80-81页 |
| 5.3 讨论 | 第81-83页 |
| 第六章 CDPK2缺失虫株的构建及免疫效果评价 | 第83-98页 |
| 6.1 材料与方法 | 第84-86页 |
| 6.1.1 虫株、细胞与实验动物 | 第84页 |
| 6.1.2 主要仪器与试剂 | 第84页 |
| 6.1.3 CDPK2敲除株的构建 | 第84页 |
| 6.1.4 PCR筛选阳性单克隆 | 第84-85页 |
| 6.1.5 CDPK2缺失株毒力检测 | 第85页 |
| 6.1.6 小鼠免疫试验 | 第85页 |
| 6.1.7 样品采集及检测 | 第85-86页 |
| 6.1.8 统计学分析 | 第86页 |
| 6.2 结果 | 第86-95页 |
| 6.2.1 RHΔCDPK2及PRUΔCDPK2虫株的构建 | 第86-87页 |
| 6.2.2 CDPK2缺失株在小鼠体内毒力的变化 | 第87-88页 |
| 6.2.3 弓形虫RH、PYS及TgC7株急性感染试验 | 第88-89页 |
| 6.2.4 弓形虫II型PRU包囊慢性感染试验 | 第89-90页 |
| 6.2.5 评价PRUΔCDPK2引起的免疫反应 | 第90-93页 |
| 6.2.6 弓形虫先天性感染试验 | 第93-94页 |
| 6.2.7 评价PRUΔCDPK2在怀孕期间引起的免疫反应 | 第94-95页 |
| 6.3 讨论 | 第95-98页 |
| 第七章 全文结论 | 第98-99页 |
| 参考文献 | 第99-108页 |
| 致谢 | 第108-109页 |
| 作者简介 | 第109-110页 |
